הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ'יק מוקדם

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Psychoyos, D., Finnell, R. Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (20), e904, doi:10.3791/904 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, הופכים אותו לכלי אידיאלי ללימוד ביטוי גנים במוח, בצינור העצבי, somite היווצרות primordia לב. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בהר 2 צבעים שלם הכלאה באתרו, ראשית, העובר גזור מן הביצה ואת קבוע paraformaldehyde. שנית, העובר עיבוד עבור prehybridization. העובר היא הכלאה אז עם שתי בדיקות שונות, אחת יחד לחפור, ואף אחד מצמידים את FITC. בעקבות הכלאה בין לילה, העובר הוא מודגרות עם נוגדנים בשילוב לחפור. תגובת צבע על מצע DIG מבוצע, ואת האזור של עניין נראה כחול. העובר הוא מודגרות אז בשילוב עם נוגדנים FITC. העובר מעובד לתגובת צבע עם FITC, ואת האזור של עניין נראה אדום. לבסוף, העובר מקובע ומעובד phtograph ואת חתך. מדריך לפתרון בעיות מוצג גם.

Protocol

חלק 1: תיקון העוברים

  1. מלאו צלחת דיסקציה עם קרח קר depc-PBS. שמור על הקרח. פתח את הביצה על ידי הקשה על פגז עם מלקחיים ולהסיר חתיכות הקליפה.
  2. הסר עבה אלבומין עם מלקחיים. הטיה שק חלמון עם מלקחיים גס כל כך העובר הפונה כלפי מעלה.
  3. בעזרת מספריים לחתוך ריבוע של שק חלמון סביב העובר.
  4. בעזרת כף, להסיר העובר מן החלמון ומניחים על קרח קר depc-PBS.
  5. מתחת למיקרוסקופ, להסיר ממברנות חלמון ולהעביר לצלחת קיבעון.
  6. הצמד מטה, להסיר depc-PBS. החלף PFA 4% ב-PBS depc ולתקן O / N ב 4 ° C.
  7. הסר מקבע. החלף עם קרח קר depc-PBS. באמצעות מחט סוף בוטה microcapillary או סכין microdissection, לחרר את מערכת העצבים ואת החללים בלב, כדי למנוע השמנה של בדיקה.
  8. לשטוף 2x 10 mn depc-PBS עם 0.1% Tween-20 (PBT). מייבשים 10 mn כל אחד 25%, 50%, 75% מתנול PBT. מייבשים עוברים פעמיים מתנול 100%. חנות ב -20 מעלות צלזיוס מתנול.

חלק 2: Prehybridization

  1. רעננותם עוברים 10 mn כל אחד 75%, 50% מתנול 25% PBT. לשטוף 2x 10 mn ב PBT.
  2. בינתיים, להכין מקבע קרים (paraformaldehyde 4% PBT). החלף PBT עם פתרון K proteinase (3 מ"ל / בקבוקון; [? 5 גרם / מ"ל] הסופי PBT). ודא את הבקבוקון כולו חשוף הפתרון K proteinase ידי בעדינות מגלגלים את הבקבוקון, ראה פתרון בעיות עבור זמני חשיפה.
  3. באמצעות RNase חינם פיפטה פסטר להסיר proteinase K ולהוסיף מקבע (2 מ"ל). מיד מקום על קרח בדיוק 20 mn.
  4. שוטף כל RT מבוצעות על nutator. לשטוף 2x 10 mn ב PBT, ו 1x 10mn ב PBT המכילות חיץ הכלאה של 50%.
  5. לשטוף 1x במאגר הכלאה. לדגור על 65 מעלות צלזיוס חוצץ 2 מ"ל הכלאה של 4-5 שעות.

חלק 3: עוברים להכליא עם בדיקות

  1. לחפור FITC סינתזה בשילוב בדיקה מתואר בנספח. החללית צפויה לתת איתות חזק, צריך להיות עם synhesized FITC המכילים נוקלאוטידים; בדיקה חלש צריך להיות מסונתז עם עם DIG המכילים נוקלאוטידים.
  2. בדיקות Prewarm במאגר הכלאה (500 ng / ml כ"א) באמצעות בקבוקון 2 מ"ל. מיד להחליף את החיץ הכלאה עם פתרון בדיקה. אל תתנו עוברים יבש. דגירה של 16 שעות ב 65 ° C.
  3. החלף בדיקה עם חיץ הכלאה, 2 שוטף, כל 30 mn ב 65 ° C. שטפי 15 mn במאגר הכלאה / MABT (1 / 1 v / v /) בשעה 65 ° C.

חלק 4: הדגירה DIG נוגדן וצבע תגובה

  1. לשטוף 2x20 mn ב MABT. שטפי 1 שעות ב 2% BBR / MABT. לשטוף 5 שעות ב -2% BBR/20% היס / MABT (חסימת חיץ). דגירה של נוגדנים DIG 1:2000 מדולל חיץ חסימה, O / N ב 4 ° C על nutator.
  2. לשטוף 3x 10 mn כל MABT, ואת שעות 3x 1 כל MABT.
  3. לשטוף 2x 20 mn ב NTMT. הוסף NBT / BCIP המצע 200ul כדי NTMT 10 מ"ל. מיד להסיר NTMT מבקבוקון ולהחליף חיץ 1-2 NBT / BCIP מ"ל. מקום חשוך. צג התגובה צבע אחרי 20 mn, ובו 20 מרווחי mn לאחר מכן.
  4. בעקבות התגובה צבע (אמור להופיע כחול), להתרחץ PBS עבור 10 mn, להצמיד על צלחת קיבוע מלא PBS, ולהחליף פתרון עם PFA 4% ב-PBS. תקן O / N ב 4 ° C.
  5. העברה בקבוקון scintillation חדש. שטפי ב PBST (PBS עם 1% Tween-20) 2x10 mn. שטפי ב MABT 2x 10 mn.
  6. מדגירים את MABT 30 mn ב 63 ° C.

חלק 5: הדגירה נוגדן FITC וצבע תגובה

  1. לשטוף 2x 10 mn ב MABT, 1 שעות ב 2% BBR / MABT, 5 שעות במאגר חסימת
  2. דגירה של אלקליין phosphatase מצמידים אנטי FITC-נוגדן (1:500) O / N ב 4 ° C.
  3. לשטוף 3x 10 mn כל MABT, ואת שעות 3x 1 כל MABT.
  4. שטפי ב 2x 20 mn ב TBS pH 8.45% עם 0.1 Tween-20 (TBST).
  5. הכן וקטור האדום פתרון עובד (5 מ"ל) ב TBST באמצעות ריאגנטים 1,2 ו 3 המסופק בערכה. מיד להסיר TBST מבקבוקון ולהחליף חיץ האדום וקטור. מקום חשוך. צג התגובה צבע אחרי 40 mn, ובו 30 מרווחי mn לאחר מכן.
  6. צבע בעקבות התגובה (אמור להופיע אדום), עוברי העברה PBS.

חלק 6: קיבוע ועיבוד

  1. העברה צלחת קיבעון המכיל PBS, ולתקן PFA ב -4% במשך 20 mn ב RT או O / N ב 4 ° C.
  2. שטפי ב-PBS, 2x 10 mn. כדי תהליך הצילום, להעביר גליצרול 20% PBS (זו יהפכו את העוברים שקוף). כדי ליצור חדר, לחתוך 2 רצועות של סרט PVC, להרכיב אותם בשקופית. גזור ריבוע במרכז באמצעות להב. הסר את מלקחיים באמצעות מרובע.
  3. כדי תהליך חתך שעווה, להעביר בחזרה PBS, לשטוף 2x 10 mn, מייבשים בסדרה מדורגת של מתנול (25%, 50%, 75% ו 100% ב-PBS, 10 mn כל אחד).
  4. החלף propanol, 3mn. החלף 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, ואחריו 20 mn ידי Histoclear (2x 1 שעות). החלף histoclear / שעווה 01/01 (v / v) 60 ° C עבור 1 שעה. החלף בשעווה תהליךעבור היסטולוגיה.

חלק 7: פתרונות

חיץ הכלאה, בכל חנות -20 מעלות צלזיוס פלקון, 50 מ"ל: 25 מ"ל לפוראמיד; 3.25 מ"ל (20xSSC); 0.5 מ"ל (EDTA 0.5m); 1 מ"ל (10% Tween-20); 2.5 מ"ל (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml tRNA). 100ul (50 מ"ג / מ"ל ​​הפרין) MABT, להכין חומצה maleic 100mm; pH עד 7.5 עם NaOH כדורי. הוסף 150mm NaCl ו - 0.1% Tween-20.

NTMT (עשה רק לפני השימוש), 50 מ"ל: 1ml (NaCl 5M); 2.5 מ"ל (טריס-2M HCl pH9.5); 1.25 מ"ל (2M MgCl 2); 5 מ"ל (10% Tween-20).

TBST: טריס-HCl 0.1M, 0.15M NaCl, pH 8.45, 0.1% Tween-20.

חלק 8: פתרון בעיות

בעיה לגרום תרופה
העובר מכורבלת התייבשות התייבשות מספיק / שמור על 10 מרווחי mn במהלך התייבשות / התייבשות צעדים רצופים
אין אות בדיקה בדיקה נפגעת זיהום RNase בבקבוקון הפעל בדיקה על 1% agarose ג'ל ודא את הבקבוקון כולו חשוף הפתרון K proteinase בשלב 2
בדיקה היא תוויות חללים הלב בצינור העצבי בדיקה לכוד בשלב 2, ודא חללים כל microdissection מחורר באמצעות סכין או microcapillary
העובר התפרקה הכלאה הבא (שלב 3) צעד proteinase K שמאל טמפרטורה הכלאה זמן רב מדי הוא גבוה מדי Proteinase K אסור להשאיר יותר 1mn (שלבים 3 + ו 4), 2 mn (שלב 5 עד 7), 3 mn (שלב 80-10), 4 mn (שלב 11-13) אל להכליא ב T o גבוה מ 65 מעלות צלסיוס

חלק 9: תוצאות נציג

עוברים נציג מוצגים להלן: (א) העובר (בשלב HH7) התווית בדיקה DIG-סוקס (כחול) לבין FITC-delta-1 בדיקה (אדום). (ב) העובר (בשלב HH8) התווית בדיקה DIG-Pax6 (כחול) בדיקה FITC-ששש (אדום). NF, עצביים לקפל, ANP, צלחת עצביים PSM הקדמי, והמזודרם presomitic, n, notochord, nt, בצינור העצבי). בדיקה מתנות במעבדות של בני הזוג. ג תבין, מ Goulding, ד אנריקה, וג' בריסקו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הר 2 צבעים כולו בשיטת הכלאה באתרו משמש כדי לקבוע הן תבניות במרחב ובזמן של ביטוי גנים, תוך שימוש באחד או שני גנים של עניין. היישומים כוללים הערכת דפוסי ביטוי גנים של גנים הרומן (למשל 1,2, כמו גם שינויים עלבון גן הביטוי הבא (מניפולציות עובריים 3, 4 חרוזים, ו electroporation של רנ"א או דנ"א בונה 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מ 'מרגרט Alkek קרן אל RHF.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5
Marsh Automatic Incubator Tool Lyon RX
Hybridization Incubator Tool Hybaid Micro-4
Adams Nutator orbital mixer Tool Fisher Scientific 14-062
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Spoon Tool Fine Science Tools 10370-18
Pasteur Capillary Pipette Electron Microscopy Sciences 70950-12
Microcapillary tube Sigma-Aldrich P1049-1PAK Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Fine Science Tools 26002-20 Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
Tween-20 Reagent Sigma-Aldrich P1379-100ML
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5MG Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized Reagent Ambion 9342
Yeast tRNA-25 mg Reagent Invitrogen 15401-011 Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt Reagent Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5 Reagent Fisher Scientific PR-V4261
EDTA (0.5M) PR-V4231 Fisher Scientific
SDS Reagent Fisher Scientific BP166-100
Maleic acid Reagent Fluka 63189
B–hringer Blocking Reagent Reagent Roche Group 11096176001 Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum Reagent Jackson ImmunoResearch 013-000-121 Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
NBT/BCIP stock solution Reagent Roche Group 11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11426338910
2M Tris BP1759-500 Fisher Scientific
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit Reagent Vector Laboratories SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene Reagent Sigma-Aldrich 429325-100ML Under hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
  2. Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
  3. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
  4. Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
  5. Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).

Comments

1 Comment

  1. comment from author (DP): Pax6 expressed in neural folds and developing neural tube (Results section)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 28, 2008 - 10:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics