Dubbel Hela Montera in situ hybridisering för tidig kycklingembryon

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Denna video visar 2-färg hela montera in situ hybridisering, en metod som den rumsliga och tidsmässiga uttryck mönster av 2 olika gener kan visualiseras i ung kycklingembryon. Denna metod introducerades ursprungligen av David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham och David Ish-Horowicz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Psychoyos, D., Finnell, R. Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (20), e904, doi:10.3791/904 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den kycklingembryo är ett värdefullt verktyg i studiet av tidiga embryonala utvecklingen. Dess öppenhet, tillgänglighet och enkel manipulation, gör det ett idealiskt verktyg för att studera genuttryck i hjärnan, neuralrörsdefekter, somit och hjärta primordia formation. Denna video visar de olika stegen i 2-färg hela montera in situ hybridisering, det första är embryot skäras ut från ägget och fasta i paraformaldehyd. För det andra är embryot behandlas för prehybridization. Embryot är då hybridiseras med två olika sonder, en kombination att gräva, och en kopplad till FITC. Efter en natt hybridisering, är embryot inkuberas med DIG kopplad antikropp. Färgreaktion för dig substrat sker, och regionen av intresse visas blått. Embryot inkuberas sedan med FITC kopplad antikropp. Embryot behandlas för färgreaktion med FITC, och regionen av intresse visas rött. Slutligen är embryot fast och behandlas för phtograph och sektionering. En felsökningsguide presenteras också.

Protocol

Del 1: Fastställande av embryon

  1. Fyll dissektion fat med iskall DEPC-PBS. Håll på is. Öppna ägget genom att knacka på skalet med pincett och ta bort skal bitar.
  2. Ta bort tjocka albumin med pincett. Tilt gulesäcken med grovt pincett så att embryot vänd uppåt.
  3. Med sax, klippa en kvadrat med gulesäcken runt embryot.
  4. Använda sked, ta bort embryot från äggula och lägg på iskalla DEPC-PBS.
  5. Under mikroskop, ta bort membran och äggula och transfer till fixering maträtt.
  6. Pin ner, ta bort DEPC-PBS. Ersätt med 4% PFA i DEPC-PBS och fixa O / N vid 4 ° C.
  7. Ta bort fixativ. Ersätt med iskall DEPC-PBS. Med hjälp av en trubbig slutet microcapillary nål eller en microdissection kniv, perforera nervsystemet och håligheter hjärtat, för att förhindra fångst av sond.
  8. Tvätta 2x 10 minuter DEPC-PBS med 0,1% Tween-20 (PBT). Torka 10 minuter vardera i 25%, 50%, 75% metanol i PBT. Torka embryon två gånger i 100% metanol. Förvara vid -20 ° C i metanol.

Del 2: Prehybridization

  1. Rehydrera embryon 10 minuter vardera i 75%, 50% och 25% metanol i PBT. Tvätta 2x 10 mn i PBT.
  2. Under tiden förbereder iskall fixativ (4% paraformaldehyd i PBT). Byt PBT med proteinas K-lösning (3 ml / flaska, [? 5 g / ml] final i PBT). Se till att hela flaskan utsätts för proteinas K lösningen genom att försiktigt rulla injektionsflaskan, se Felsökning för exponeringstider.
  3. Använda RNas gratis pasteurpipett bort proteinas K och lägga fixativ (2 ml). Placera omedelbart på is i exakt 20 minuter.
  4. Alla RT tvättar utförs på nutator. Tvätta 2x 10 mn i PBT, och 1x 10min i PBT innehåller 50% hybridisering buffert.
  5. Tvätta 1x i hybridisering buffert. Inkubera vid 65 ° C i 2 ml hybridisering buffert för 4-5 tim.

Del 3: hybridisera embryon med prober

  1. Gräva och FITC kopplad sond syntesen beskrivs i tillägg. Sonden förväntas ge en stark signal, bör synhesized med FITC innehåller nukleotider, den svagare sonden ska syntetiseras med med DIG innehåller nukleotider.
  2. Prewarm sonder i hybridisering buffert (500 ng / ml vardera) med en 2 ml injektionsflaska. Genast ersätta hybridisering buffert med sonden lösningen. Låt inte embryon torka. Inkubera i 16 timmar vid 65 ° C.
  3. Byt sond med hybridisering buffert, 2 tvättar, 30 min vardera vid 65 ° C. Tvätta 15 mn i hybridisering buffert / MABT (1 / 1 v / v /) vid 65 ° C.

Del 4: DIG antikropp inkubation och färgreaktion

  1. Tvätta 2x20 mn i MABT. Tvätta 1 timme hos 2% BBR / MABT. Tvätta 5 hr i 2% BBR/20% HISS / MABT (blockerande buffert). Inkubera i 1:2000 DIG antikroppar spätts i blockerande buffert, O / N vid 4 ° C på nutator.
  2. Tvätta 3x 10 minuter vardera i MABT och 3x 1 timme vardera MABT.
  3. Tvätta 2x 20 mn i NTMT. Lägg 200ul NBT / BCIP substrat till 10 ml NTMT. Omedelbart ta bort NTMT ur flaskan och ersätt med 1-2 ml NBT / BCIP buffert. Placera i mörker. Övervaka färg reaktion efter 20 min, och 20 min därefter.
  4. Efter färgreaktion (ska visas blå), tvätta i PBS för 10 minuter, stift ner på fixering tallrik fylld med PBS, och ersätta lösning med 4% PFA i PBS. Fix O / N vid 4 ° C.
  5. Transfer till nya scintillation flaskan. Tvätta i PBST (PBS med 1% Tween-20) 2x10 minuter. Tvätta i MABT 2x 10 minuter.
  6. Inkubera i MABT 30 min vid 63 ° C.

Del 5: FITC-antikroppar inkubation och färgreaktion

  1. Tvätta 2x 10 mn i MABT, 1 timme hos 2% BBR / MABT, 5 timmar i en blockerande buffert
  2. Inkubera i alkalisk fosfatas-kopplad anti-FITC-antikroppar (1:500) O / N vid 4 ° C.
  3. Tvätta 3x 10 minuter vardera i MABT och 3x 1 timme vardera MABT.
  4. Tvätta i 2x 20 mn i TBS pH 8,45 med 0,1% Tween-20 (TBST).
  5. Förbered Vector Röd arbetar lösning (5 ml) i TBST använda reagenser 1,2 och 3 ges i satsen. Omedelbart ta bort TBST ur flaskan och ersätt med Vector Red buffert. Placera i mörker. Övervaka färgreaktion efter 40 MN, och vid 30 min mellanrum därefter.
  6. Efter färgreaktion (ska visas röd), överföring embryon till PBS.

Del 6: fixering och bearbetning

  1. Transfer till fixering maträtt som innehåller PBS, och fixa i 4% PFA för 20 mn på RT eller O / N vid 4 ° C.
  2. Tvätta i PBS, 2x 10 minuter. För att processen för fotografering, överföring till 20% glycerol i PBS (detta kommer att göra embryon genomskinliga). För att skapa en kammare, skär 2 remsor av PVC-tejp, lägga dem på bild. Skär en fyrkant i mitten med ett blad. Ta torget med hjälp av pincetten.
  3. För att processen för vax sektionering, transport tillbaka till PBS, tvätta 2x 10 minuter, torkar i graderade serier av metanol (25%, 50%, 75% och 100% i PBS, 10 minuter vardera).
  4. Ersätt med propanol, 3mn. Ersätt med 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, följt 20 MN Av Histoclear (2x 1 tim). Ersätt med histoclear / vax 1 / 1 (v / v) 60 ° C under 1 timme. Ersätt med vax en processför histologi.

Del 7: Lösningar

Hybridisering bufferten förvaras vid -20 ° C i Falcon, 50 ml: 25 ml formamid, 3,25 ml (20xSSC), 0,5 ml (0,5 EDTA), 1 ml (10% Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) , 125 ul (20mg/ml tRNA). 100ul (50 mg / ml heparin) MABT, förbereda 100mm maleinsyra, pH till 7,5 med NaOH pellets. Lägg 150mm NaCl och 0,1% Tween-20.

NTMT (gjort precis före användning), 50 ml: 1 ml (5M NaCl), 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9.5), 1,25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (10% Tween-20).

TBST: 0,1 miljoner Tris-HCl, 0,15 NaCl, pH 8,45, 0,1% Tween-20.

Del 8: Felsökning

Problem Orsak Remedy
Embryo är böjt upp Otillräcklig uttorkning / rehydrering Behåll 10 minuter intervaller under successiva uttorkning / rehydrering steg
Det finns ingen sond signal Probe bryts ned RNas föroreningar i flaskan Kör sond på 1% agarosgel Se till att hela flaskan utsätts för proteinas K-lösning i steg 2
Probe är etiketter hålrum i hjärtat en neuralrörsdefekter Probe är instängd I steg 2, se till att alla hålrum är perforerade med microdissection kniv eller microcapillary
Embryo upplöstes efter hybridisering (steg 3) Proteinas K steg kvar för länge Hybridisering temperaturen är för hög Proteinas K bör inte lämnas längre än 1mn (steg 3 + och 4), 2 MN (steg 5 till 7), 3 MN (steg 8-10), 4 MN (stadium 11-13) Har hybridisera inte vid T o högre än 65 ° C

Del 9: representativa resultat

Representant embryon visas nedan: (A) Embryo (etapp HH7) är märkt med en DIG-Sox sond (blå) och en FITC-delta-1 sond (röd). (B) Embryo (etapp HH8) är märkt med en DIG-Pax6 sond (blå) och en FITC-Shh sond (röd). Nf, neurala gånger, ANP, främre neurala plattan, PSM, presomitic mesoderm, n, notochord, NT, neuralrörsdefekter). Probe gåvor från laboratorier Dr. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, och J. Briscoe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den 2-färg hela montera in situ hybridisering metoden används för att bestämma både rumsliga och tidsmässiga mönster av genuttryck, med en eller två gener av intresse. Applikationer inkluderar bedömning av mönster genuttryck av nya gener (t.ex. 1,2, liksom förändringar i genuttryck efter förolämpning (embryonala manipulationer 3, pärlor 4 och elektroporation av RNA eller DNA konstruktioner 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Margaret M. Alkek Foundation för att RHF.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5
Marsh Automatic Incubator Tool Lyon RX
Hybridization Incubator Tool Hybaid Micro-4
Adams Nutator orbital mixer Tool Fisher Scientific 14-062
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Spoon Tool Fine Science Tools 10370-18
Pasteur Capillary Pipette Electron Microscopy Sciences 70950-12
Microcapillary tube Sigma-Aldrich P1049-1PAK Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Fine Science Tools 26002-20 Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
Tween-20 Reagent Sigma-Aldrich P1379-100ML
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5MG Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized Reagent Ambion 9342
Yeast tRNA-25 mg Reagent Invitrogen 15401-011 Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt Reagent Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5 Reagent Fisher Scientific PR-V4261
EDTA (0.5M) PR-V4231 Fisher Scientific
SDS Reagent Fisher Scientific BP166-100
Maleic acid Reagent Fluka 63189
B–hringer Blocking Reagent Reagent Roche Group 11096176001 Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum Reagent Jackson ImmunoResearch 013-000-121 Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
NBT/BCIP stock solution Reagent Roche Group 11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11426338910
2M Tris BP1759-500 Fisher Scientific
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit Reagent Vector Laboratories SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene Reagent Sigma-Aldrich 429325-100ML Under hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
  2. Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
  3. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
  4. Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
  5. Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).

Comments

1 Comment

  1. comment from author (DP): Pax6 expressed in neural folds and developing neural tube (Results section)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 28, 2008 - 10:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics