Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Psychoyos, D., Finnell, R. Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (20), e904, doi:10.3791/904 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

El embrión de pollo es una herramienta valiosa en el estudio del desarrollo embrionario temprano. Su transparencia, accesibilidad y facilidad de manipulación, lo hacen una herramienta ideal para estudiar la expresión génica en el cerebro, tubo neural, somite y la formación de primordios corazón. Este video muestra los diferentes pasos en el monte de 2 colores toda la hibridación in situ, En primer lugar, el embrión se diseca del huevo y se fijaron en paraformaldehído. En segundo lugar, el embrión se procesa para prehibridación. El embrión se hibrida con dos sondas diferentes, una junto a la DIG, y un acoplado a FITC. Tras la hibridación noche a la mañana, el embrión se incuba con anticuerpo acoplado DIG. Reacción de color de sustrato DIG se lleva a cabo, y la región de interés se ve azul. El embrión se incuba con anticuerpos FITC acoplados. El embrión se procesa para la reacción de color con FITC, y la región de interés se ve rojo. Finalmente, el embrión se fija y se procesaron para phtograph y seccionamiento. Una guía de solución de problemas también se presenta.

Protocol

Parte 1: La fijación de los embriones

  1. Rellene plato disección con helada DEPC PBS. Mantener en hielo. Abrir el huevo tocando la concha con una pinza y retirar pedazos de la cáscara.
  2. Eliminar la albúmina de espesor con pinzas. Inclinación del saco vitelino con pinzas gruesas para que el embrión hacia arriba.
  3. Con la tijera, cortar un cuadrado de alrededor del saco vitelino del embrión.
  4. Usando una cuchara, retire embrión a partir de yema de huevo y colocar en hielo frío DEPC PBS.
  5. Bajo el microscopio, retire las membranas y la yema y traslado al plato de fijación.
  6. Precisar, eliminar DEPC PBS. Reemplazar con PFA al 4% en PBS con DEPC y fijar O / N a 4 ° C.
  7. Eliminar el fijador. Vuelva a colocar con helada DEPC PBS. Utilizando una aguja de punta roma microcapilar o un cuchillo de microdisección, perfore el sistema nervioso y las cavidades del corazón, para evitar la captura de la sonda.
  8. Lavar 2 veces 10 minutos con DEPC PBS con 0,1% de Tween-20 (PBT). Deshidratar 10 minutos cada uno en el 25%, 50%, 75% de metanol en PBT. Deshidratar los embriones en dos ocasiones en metanol al 100%. Almacenar a -20 ° C en metanol.

Parte 2: prehibridación

  1. Rehidratar embriones 10 minutos cada uno en el 75%, 50% y 25% de metanol en PBT. Lavar 2 veces 10 minutos en PBT.
  2. Mientras tanto, prepare fijador fría (4% de paraformaldehído en PBT). Vuelva a colocar PBT con proteinasa K solución (3 ml / vial; [? 5 g / ml] final en PBT). Asegúrese de que el vial está expuesto a una solución de proteinasa K por suaves ondulaciones del vial, consulte Solución de problemas para los tiempos de exposición.
  3. Utilizando RNasa libre pipeta Pasteur eliminar proteinasa K y añadir el fijador (2 ml). Colocar inmediatamente en hielo durante exactamente 20 minutos.
  4. Todos los lavados se llevan a cabo en la RT nutator. Lavar 2 veces 10 minutos en el PBT, y 1x 10mn en PBT con 50% de tampón de hibridación.
  5. Lavado 1X en tampón de hibridación. Se incuba a 65 ° C en 2 ml de tampón de hibridación 05.04 horas.

Parte 3: embriones híbridos con sondas

  1. DIG y FITC síntesis de la sonda unida se describe en el Apéndice. La sonda de espera para dar una señal fuerte, debe ser synhesized con FITC-que contiene nucleótidos, la sonda más débiles deben ser sintetizados con con DIG-que contiene los nucleótidos.
  2. Precaliente sondas de hibridación de amortiguación (500 ng / ml cada una) mediante un vial de 2 ml. Rápidamente reemplazar el tampón de hibridación con la solución de la sonda. No deje que los embriones seco. Incubar durante 16 horas a 65 ° C.
  3. Vuelva a colocar la sonda con el tampón de hibridación, lavados de 2, 30 mn cada uno a 65 ° C. Lavado de 15 minutos en tampón de hibridación / MABT (1 / 1 v / v /) a 65 ° C.

Parte 4: incubación DIG anticuerpos y la reacción de color

  1. Lave 2x20 mn en MABT. Lavado de 1 hora en el 2% BBR / MABT. Lávese las 5 horas en el 2% BBR/20% HISS / MABT (tampón de bloqueo). Incubar en 1:2000 de anticuerpos DIG diluido en tampón de bloqueo, O / N a 4 ° C en nutator.
  2. Lave 3 veces cada 10 minutos en MABT, y 3x 1 hora cada uno en MABT.
  3. Lavar 2 veces 20 minutos en NTMT. Añadir 200ul NBT / BCIP sustrato NTMT de 10 ml. Quitarse de inmediato NTMT de vial y reemplazar con 1-2 ml NBT / BCIP buffer. Lugar en la oscuridad. Monitorear la reacción de color después de 20 minutos y, posteriormente, a intervalos de 20 mn.
  4. Tras la reacción de color (azul debe aparecer), lavar en PBS durante 10 minutos, de precisar en un plato lleno de fijación con PBS, y reemplazar la solución con 4% PFA en PBS. Fix O / N a 4 ° C.
  5. Traslado al nuevo vial de centelleo. Lave en PBST (PBS con 1% de Tween-20) 2x10 mn. Lave en MABT 2x 10 mn.
  6. Incubar en MABT 30 minutos a 63 ° C.

Parte 5: incubación de anticuerpos FITC y color de la reacción

  1. Lavar 2 veces 10 minutos en MABT, 1 hora en el 2% BBR / MABT, 5 horas en tampón de bloqueo
  2. Incubar en la fosfatasa alcalina-junto anti-FITC-anticuerpo (1:500) O / N a 4 ° C.
  3. Lave 3 veces cada 10 minutos en MABT, y 3x 1 hora cada uno en MABT.
  4. Lave en 2x 20 minutos en TBS pH 8,45, con 0,1% de Tween-20 (TBST).
  5. Prepare una solución vectorial Red de trabajo (5 ml) en TBST utilizando reactivos 1,2 y 3 incluye en el kit. Quitarse de inmediato la TBST de vial y reemplazar con el vector de búfer Roja. Lugar en la oscuridad. Monitorear la reacción de color después de 40 minutos, y en intervalos de 30 mn a partir de entonces.
  6. Tras la reacción de color (deben aparecer de color rojo), los embriones de transferencia de PBS.

Parte 6: La fijación y el procesamiento

  1. Traslado al plato de fijación que contiene PBS, y fijar en PFA al 4% durante 20 min a temperatura ambiente o S / N a 4 ° C.
  2. Se lavan con PBS, 2 veces 10 minutos. Para el proceso de la fotografía, la transferencia y el 20% de glicerol en PBS (esto hará que los embriones transparentes). Para crear una cámara, cortar dos tiras de cinta de PVC, superponerlos en la diapositiva. Corte un cuadrado en el centro con una cuchilla. Retire las pinzas cuadrados utilizando.
  3. Para el proceso de corte de cera, traslado de regreso a la PBS, lavar 2 veces 10 minutos, deshidratar en serie gradual de metanol (25%, 50%, 75% y 100% en PBS, a 10 minutos cada uno).
  4. Reemplazar con propanol, 3 millones. Reemplazar con 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, a 20 minutos seguido por Histoclear (2x 1 hora). Reemplazar con histoclear / cera 1 / 1 (v / v) 60 ° C durante 1 hora. Vuelva a colocar la cera de un procesode la histología.

Parte 7: Soluciones

Tampón de hibridación, almacenar a -20 ° C en Falcón, 50 ml: 25 ml de formamida, 3.25 ml (20xSSC), 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (10% de Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) , 125 ul (20mg/ml tRNA);. 100ul (50 mg / ml de heparina) MABT, preparar ácido maleico 100 mM, pH de 7,5 con NaOH pellets. Añadir 150 mM NaCl y 0,1% Tween-20.

NTMT (hace justo antes de su uso), 50 ml: 1 ml (5M NaCl) 2,5 ml (2 M Tris-HCl pH9.5), 1,25 ml (2 M MgCl 2), 5 ml (10% de Tween-20).

TBST: 0,1 M Tris-HCl, NaCl 0,15 M, pH 8,45, 0,1% Tween-20.

Parte 8: Solución de problemas

Problema Causa Remedio
Embrión es un ovillo Deshidratación insuficiente / rehidratación Mantener intervalos de 10 mn durante los sucesivos deshidratación / rehidratación pasos
No hay ninguna señal de la sonda La sonda se degrada la contaminación RNasa en vial Ejecutar la sonda en un 1% en gel de agarosa Asegúrese de que el vial está expuesto a la proteinasa K solución en el paso 2
La sonda está etiquetas cavidades del corazón de un tubo neural La sonda está atrapado En el paso 2, asegúrese de que todas las cavidades están perforadas con un cuchillo o microdisección microcapilar
Embrión se desintegró después de la hibridación (paso 3) Proteinasa K paso a la izquierda la temperatura de hibridación demasiado tiempo es demasiado alto Proteinasa K no se debe dejar más de 1 millón de (etapas 3 + y 4), 2 mn (fase 5 a 7), 3 mn (fase 8-10), 4 mn (etapa 11-13) no hibridan en T o superior de 65 º C

Parte 9: Resultados de Representante

Embriones representativos se muestran a continuación: (A) embrión (fase HH7) está marcado con una sonda DIG-Medias (azul) y FITC-delta-1 de la sonda (rojo). (B) embrión (fase HH8) está marcado con una sonda DIG-Pax6 (azul) y una sonda FITC-Shh (rojo). NF, de los nervios veces, la ANP, la placa neural anterior, psm, mesodermo presomitic, n, notocorda, nt, del tubo neural). Regalos de la sonda de los laboratorios de los doctores. C. Tabin, M. Goulding, Henrique D., y J. Briscoe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Todo el monte de 2 colores en el método de hibridación in situ se utiliza para determinar los patrones espaciales y temporales de la expresión génica, utilizando uno o dos genes de interés. Las aplicaciones incluyen la evaluación de patrones de expresión génica de los genes de la novela (por ejemplo, 1,2, así como los cambios en la expresión génica insulto siguientes (manipulaciones embrionarias 3, 4 bolas, y la electroporación de ARN o ADN construye 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Margaret M. Alkek a RHF.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5
Marsh Automatic Incubator Tool Lyon RX
Hybridization Incubator Tool Hybaid Micro-4
Adams Nutator orbital mixer Tool Fisher Scientific 14-062
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Spoon Tool Fine Science Tools 10370-18
Pasteur Capillary Pipette Electron Microscopy Sciences 70950-12
Microcapillary tube Sigma-Aldrich P1049-1PAK Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Fine Science Tools 26002-20 Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
Tween-20 Reagent Sigma-Aldrich P1379-100ML
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5MG Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized Reagent Ambion 9342
Yeast tRNA-25 mg Reagent Invitrogen 15401-011 Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt Reagent Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5 Reagent Fisher Scientific PR-V4261
EDTA (0.5M) PR-V4231 Fisher Scientific
SDS Reagent Fisher Scientific BP166-100
Maleic acid Reagent Fluka 63189
B–hringer Blocking Reagent Reagent Roche Group 11096176001 Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum Reagent Jackson ImmunoResearch 013-000-121 Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
NBT/BCIP stock solution Reagent Roche Group 11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11426338910
2M Tris BP1759-500 Fisher Scientific
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit Reagent Vector Laboratories SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene Reagent Sigma-Aldrich 429325-100ML Under hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
  2. Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
  3. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
  4. Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
  5. Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).

Comments

1 Comment

  1. comment from author (DP): Pax6 expressed in neural folds and developing neural tube (Results section)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 28, 2008 - 10:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics