입양 DTH의 유도 후 귀에 영상 효과기 메모리 T 세포

Biology

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Summary

여기서 우리는 쥐의 귀에 지연 유형 과민성 (DTH) 반응의 진행 상황을 유도하고 기록하는 방법을 보여줍니다. 이것은 이펙터 / 메모리 T 세포 응답의 2 광자 이미징을위한 쥐의 귀 조직의 준비 시범옵니다.

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Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

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Abstract

효과기 / 메모리 T의 lymphocytes - 지연 유형 과민성 (DTH)은 주요 선수들이 CCR7하는 면역 반응이다. 여기, 우리는 쥐의 귀에 DTH 반응의 진행 상황을 유도하고 기록하는 방법을 보여줍니다. 효과기 / 메모리 T 세포 응답 - ​​이것은 CCR7의 2 광자 이미징을위한 쥐의 귀 조직의 준비 시범옵니다.

효과기 / 메모리 T 세포 라인 (비튼, C J. 시각 실험, 이슈 8) - 입양 DTH는 GFP - 레이블 OVA 특정 CCR7의 intraperitoneal 주사로 유도합니다. 전지는 다음 시각화를 허용하도록 텍사스 - 레드에 OVA와 OVA 복합의 1:1 혼합 (OVA - TR)과 호수 (제어 EAR)과 다른 하나의 귀를 주사하여 도전하기 전에 48 시간 동안 쥐의 평형을 사용할 수 있습니다 주민 항원 제시 세포.

우리는 영상 두번째 고조파 생성하여 콜라겐 섬유의 시각화와 함께 면역 반응 동안 피부 깊은 계층 내에서 세포의 운동성 유용 조직 준비 방법을 설명합니다. 귀 조직은 5 X 5mm의 사각형 (약간 큰 더이다)​​로 절단 후 37 이미징 챔버에 실리콘 그리스를 사용하여 보안과 산소 - 부풀어 오른 조직 문화 매체에 의해 superfused 아르 Vetbond ™를 사용하여 플라스틱 커버 미끄러져에 탑재되어 ° C .

Protocol

입양 DTH의 유도

조브 문서를 참조하십시오 : 고양이의 입양 지연 유형 과민성의 유도 및 모니터링
크리스틴 비튼, 조지 K. Chandy
생리학 및 생물 물리학의학과 캘리포니아 대학, 어바인
J. 시각 실험, 제 8

여기, 우리는 phagocytic 항원 제시 세포의 시각화 수 있도록 레이블이 지정되지 않은 항원과 1:1 비율 항원 (Ovalbumin) 텍사스 - 레드에 복합을 사용하여이 프로토콜을 수정했습니다.

이어 조직 하베스트

  1. 귀하의 승인된 동물 프로토콜에 명시된 절차에 의해 원하는 시간 지점에서 쥐를 안락사. 여기, 우리는 isoflurane 마취의 과용을 사용합니다. 이것은 통풍이 잘 후드 안에있는 닫힌 용기에 이루어집니다. 동물의 흉강을 열고 심장을 절단하여 중 잘린에 의해 죽었다는 보장합니다.

  2. 큰 가위를 사용하면 가능한 한 동물의 몸에 가까운 싱글 컷 (그림 1)과 귀를 제거합니다.

    Figure_1.jpg
    그림 1. 쥐 (内耳)의 제거

  3. 얼음처럼 차가운 1X PBS 또는 RPMI - 1640의 ~ 10 ML을 포함한 15 ML 원뿔 관에 귀를를 놓습니다. 이 영상에 대한 조직을 준비하는 준비가 될 때까지 얼음 조직 샘플을 보관.

  4. 최대한 빨리 이미지를 조직, 우리는 수확 즉시 군데 조직에 비해 얼음 1로 2 시간 조직에있는 세포 운동성에 뚜렷한 효과가 없다고하지만, 찾으십시오.

이미징을위한 조직 준비

표피와 피부 레이어의 I. 제거

* 참고 : 깊은 피부 레이어는 그대로 보관해야합니다. 제대로하면 큰 혈관은 그대로 유지되며 귀의 연골이 노출되지 않습니다. 더 염증 (관리 규정)이없는 특히 이것은 어려운 기술이며 그것은 해부 현미경을 사용하여 도움이됩니다.

  1. 10cm 조직 문화 요리에있는 원뿔 관의 조직과 언론 모두를 놓습니다.

  2. 장갑 낀 손 (그림 2) 최대 직면하고있는 귀의 지느러미 측면과 귀 (말초)의 끝에 부드럽게 쥐의 귀를하라.

    Figure_2.jpg
    그림 2. 귀에에서 트림 모피

  3. 귀 상단, 깊은 진피에서 진피를 분리 폐쇄 더몬트 끝 # 5 가위를 사용하는 동안 지속적인 조직에 엄지손가락으로. 귀 가장자리 피부 / 깊은 진피의 오버행이있다면 또는, 이것은 집게로 파악 할 수 있으며 부드럽게 아래 조직 (그림 3)에서 이것을 분리 뽑아.

    Figure_3.jpg
    그림 3. 상단 진피의 제거

  4. 일단 피부의 작은 지역 또는 부드럽게 제거하고 피부 dislodged에서 껍질로 피부 레이어와 집게 사이자를 가위를 사용하여 분리 단계를 반복, 기본 조직에서 분리되었습니다.

  5. 5 × 5 mm 또는 항원 주입의 초기 사이트 (그림 4)에서 최소 3mm는 귀 조직의 큰 영역을 쉽게받을 수 있습니다.

    Figure_4.jpg
    그림 4. 이미지에 대한 노출 조직

II. 이미징 스테이지에 조직을 확보

  1. 준비 조직보다 약간 큰 크기로 플라스틱 커버 슬립 컷.

  2. 3M Vetbond 슬라이드에 걸쳐 ™ 조직 안전한 접착제의 얇은 레이어를 확산.

  3. 준비된 조직 (이 이미지에 가능성이있는 곳으로 가는게)의 코너를 파악, 미디어에서 제거하고, 소량은 렌즈 종이나 Kym에있는 조직의 아래쪽 초과 미디어를 제거하는 닦으십시오.

  4. 접착제 커버 슬라이드 (즉시 서부 유럽 표준시 조직에 Vetbond 치료)로 조직의 가장자리를 터치. 부드럽게 (그림 5) 슬라이드를 만진되는 반대 엔드와, 평면 조직을 스트레칭

    Figure_5.jpg
    그림 5. 쪽지를 커버하기 위해 조직을 마운트

  5. 로 반전 조직 샘플 / 슬라이드 및 조직 및 슬라이드가 45도 각도로 얼굴 아래로 약하는 등 미디어 저수지에서 수영. Vetbond ™ 치료 각도에 거꾸로 조직을 개최하면 노출된 조직 표면에 경화에서 초과 접착제를 방지하는 데 도움이됩니다. 조직의 표면에 접착제가 레이저 (그림 6)을 차단합니다.

    Figure_6.jpg
    그림 6. vetbond 조직 GLU 치료미디어 마른하여 전자

    참고 : 단계 2-5은 마스터에 약간의 연습이 걸릴 수 있습니다. 처음 시도하기 전에 삭제 또는 추가 조직 조각과 연습을보십시오.

  6. 슬라이드의 맨 아래에 실리콘 그리스의 DAB는 작은 금액입니다.

  7. 재관류 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 재관류 미디어는 37 ° C를 흐르는하고 조직을 추가하기 전에 산소 있는지 확인합니다. 부드럽게 재관류 챔버의 바닥 및 플라스틱 커버 슬립 사이에 실리콘 그리스와 도장을 만들어 슬라이드의 가장자리 아래로 누르십시오.

III. 두 광자 이미징

  1. 밝은 - 현장 빛의 전송을 사용하여 조직의 꼭대기에 중점을두고 있습니다. 조명의 모든 전원을 끕니다.

  2. 레이저를 켜고, 귀하의 다중 광자 현미경 시스템에 필요한 PMTs.

  3. 높은 주문한 섬유 단백질의 두 번째 고조파 세대 (SHG) (콜라겐과 마이 오신)은 여기 레이저의 절반 파장에서 신호를 생산하고 있습니다. 우리는 현미경의 "푸른"채널을 사용하여 시각 수있는 450 nm의에서 SHG에 이르는, 900 nm의 여기에서를 사용합니다. 세대 SHG 것은 비선형 (2 광자) 과정이며, 따라서 형광의 2 광자 여기의 비슷한 광학 "sectioning"효과를 제공합니다. 병렬로 실행 원섬유이 시각되지 않습니다 반면 SHG의 절정 효율성은 원섬유는 레이저로 수직 때 발생 1.

  4. 세포 가득한 좋은 이미지 영역을 찾아, 세포의 대부분 중앙에 있으며, 영상을 시작 귀하의 수집 영역을 설정합니다. 참고 : DTH 반응, T 세포와 다른 세포 infiltrates는 종종 다른 분야 세포 2 침투은없는하는 동안 함께 집중해야 볼 수 있습니다. 따라서 이미지에 가장 좋은 지역을 찾으려면 조직을 검색 시간이 좀 걸릴 수 있습니다.

  5. 이미징 동안 셀 속도와 극성을 평가하여 세포 생존을위한 확인하십시오. 최소한 사진 손상을 보장하기 위해 허용되는 이미지 품질을 제공하는 낮은 레이저 파워를 사용하십시오.

  6. 필요에 따라 새로운 조직 준비 스왑.

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References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

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