इमेजिंग दत्तक डीटीएच की प्रेरण के बाद effector मेमोरी कान में टी कोशिकाओं

Biology

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Summary

यहाँ हम उत्प्रेरण और रिकॉर्डिंग एक विलंबित प्रकार hypersensitivity प्रतिक्रिया चूहे के कान में (डीटीएच) की प्रगति के लिए एक विधि का प्रदर्शन. यह effector / स्मृति टी सेल प्रतिक्रिया की दो photon इमेजिंग के लिए चूहे कान ऊतक की तैयारी के एक प्रदर्शन के द्वारा पीछा किया जाता है.

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Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

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Abstract

- विलंबित प्रकार hypersensitivity (डीटीएच) एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है जिसमें मुख्य खिलाड़ियों CCR7 हैं effector / स्मृति टी lymphocytes है . यहाँ, हम उत्प्रेरण और रिकॉर्डिंग चूहे के कान में एक डीटीएच प्रतिक्रिया की प्रगति के लिए एक विधि का प्रदर्शन. Effector स्मृति / टी सेल प्रतिक्रिया - यह CCR7 के दो photon इमेजिंग के लिए चूहे कान ऊतक की तैयारी के एक प्रदर्शन के द्वारा पीछा किया जाता है.

Effector स्मृति / टी सेल लाइन (Beeton, सी जे visualized प्रयोगों, 8 अंक) - एक दत्तक डीटीएच GFP लेबल OVA विशेष CCR7 के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा प्रेरित है. कोशिकाओं तो चूहे में खारा (नियंत्रण कान) और अन्य के साथ एक 1:1 OVA और OVA संयुग्मित टेक्सास लाल मिश्रण (OVA-टी.आर.) के साथ एक कान के दृश्य की अनुमति इंजेक्शन द्वारा 48 घंटे के लिए चुनौती पहले संतुलित करने के लिए अनुमति दी जाती है निवासी प्रतिजन कोशिकाओं पेश की.

हम ऊतक एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान गहरी त्वचीय कोलेजन फाइबर के दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी द्वारा दृश्य के साथ संयोजन के रूप में, परत के भीतर कोशिकाओं की गतिशीलता इमेजिंग के लिए उपयोगी तैयारी की एक विधि का वर्णन. कान ऊतक 5 एक्स 5 मिमी वर्गों (थोड़ा बड़ा बेहतर है) में कटौती की है और प्लास्टिक कवर Vetbond ™ का उपयोग कर निकल जाता है, जो तब एक इमेजिंग कक्ष में सिलिकॉन तेल का उपयोग सुरक्षित हैं और 37 में ऑक्सीजन bubbled टिशू कल्चर माध्यम द्वारा superfused पर मुहिम शुरू की डिग्री सेल्सियस .

Protocol

दत्तक डीटीएच की प्रेरण

जौव लेख कृपया देखें: प्रेरण और चूहों में दत्तक विलंबित प्रकार hypersensitivity की निगरानी
क्रिस्टीन Beeton, जॉर्ज के.एच. चांडी
फिजियोलॉजी और बायोफिज़िक्स विभाग, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, Irvine
जे visualized प्रयोगों, 8 अंक

यहाँ, हम unlabeled प्रतिजन के साथ एक 1:1 के अनुपात में प्रतिजन (Ovalbumin) टेक्सास रेड के लिए संयुग्मित phagocytic प्रतिजन कोशिकाओं पेश के दृश्य के लिए अनुमति का उपयोग करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया है.

कान ऊतक हार्वेस्ट

  1. वांछित समय बिंदु पर अपनी मंजूरी दे दी जानवर प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रक्रियाओं द्वारा चूहे euthanize. यहाँ, हम चतनाशून्य करनेवाली औषधि के एक ज्यादा, isoflurane का उपयोग करें. यह एक अच्छी तरह हवादार हुड के अंदर स्थित एक बंद कंटेनर में किया जाता है. सुनिश्चित करें कि जानवर वक्ष गुहा खोलने और दिल को काटने के द्वारा या तो कत्ल से मर चुका है.

  2. बड़ी कैंची का प्रयोग एक एकल कटौती, के रूप में संभव के रूप में में पशु के शरीर के करीब (चित्रा 1) के साथ कान हटायें.

    Figure_1.jpg
    चित्रा 1. चूहे कान का हटाना

  3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब युक्त ~ बर्फ ठंड 1x पीबीएस या RPMI 1640 के 10 मिलीलीटर में कान रखें. बर्फ के ऊतकों के नमूनों पर रखें जब तक आप इमेजिंग के लिए ऊतक तैयार करने के लिए तैयार हैं.

  4. छवि जितनी जल्दी हो सके ऊतक, हम पाते हैं, हालांकि, कि बर्फ पर 1 से 2 घंटे के ऊतकों में सेल गतिशीलता पर कोई discernable प्रभाव है जब काटा और तुरंत imaged ऊतकों की तुलना में.

ऊतक इमेजिंग के लिए तैयार

Epidermal और त्वचीय परत की मैं निकालना

* नोट: गहरी त्वचीय परत बरकरार रखा जाना चाहिए. यदि सही ढंग से किया बड़े रक्त वाहिकाओं बरकरार रहेगा और कान के कार्टिलेज को उजागर नहीं किया जाएगा. यह एक मुश्किल तकनीक है, खासकर जब वहाँ कोई सूजन (नियंत्रण शर्तों) है और यह विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए उपयोगी है.

  1. दोनों और एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति डिश में शंक्वाकार ट्यूब से ऊतक मीडिया प्लेस.

  2. Gloved हाथों चूहे कान पकड़ धीरे ऊपर का सामना करना पड़ रहा कान (चित्रा 2) के पृष्ठीय पक्ष के साथ कान (डिस्टल) की नोक पर.

    Figure_2.jpg
    चित्रा 2. कान बंद छाँटो फर

  3. कान, स्थिर जबकि बंद Dumont की टिप # 5 कैंची का उपयोग करने के लिए गहरी dermis से dermis अलग ऊतक के शीर्ष पर अपने अंगूठे के साथ. वैकल्पिक रूप से, अगर कान के किनारे त्वचा / गहरी dermis के एक अधिकता है, इस संदंश के साथ समझा जा सकता है और धीरे इस के नीचे के ऊतकों (चित्रा 3) से अलग खींच लिया.

    Figure_3.jpg
    चित्रा 3. ऊपरी dermis की हटाया

  4. एक बार त्वचा के एक छोटे से क्षेत्र के अंतर्निहित ऊतकों से अलग हो गया है, जुदाई कदम दोहराने वैकल्पिक कैंची का उपयोग करने के लिए कटौती त्वचीय परतों और संदंश के बीच धीरे हटाने और उखाड़ फेंकना त्वचा बंद छील.

  5. एक 5 x 5 मिमी या कान ऊतक कि प्रतिजन इंजेक्शन के प्रारंभिक साइट (चित्रा 4) से कम से कम 3 मिमी के बड़े क्षेत्र बेनकाब.

    Figure_4.jpg
    चित्रा 4. ऊतक इमेजिंग के लिए उजागर

द्वितीय. इमेजिंग स्टेज ऊतक सुरक्षित

  1. तैयार ऊतकों की तुलना में थोड़ा बड़ा आकार के एक प्लास्टिक कवर पर्ची काटें.

  2. 3M ™ स्लाइड भर में गोंद ऊतक सुरक्षित Vetbond की एक पतली परत बिखरा हुआ है.

  3. तैयार ऊतक (जहाँ आप छवि के लिए की संभावना नहीं कर रहे हैं) के कोने मुट्ठी, मीडिया से दूर है, और थपका लेंस कागज या Kym पर ऊतक के नीचे के लिए अतिरिक्त मीडिया को दूर पोछ लो.

  4. गोंद कवर स्लाइड (गीला ऊतक पर तुरंत Vetbond इलाज) ऊतक के किनारे टच. धीरे ऊतक फ्लैट विपरीत पिछले स्लाइड स्पर्श (चित्रा 5) किया जा रहा अंत के साथ, खिंचाव

    Figure_5.jpg
    चित्रा 5. ऊतक माउंट पर्ची कवर

  5. Inverting ऊतक / नमूना स्लाइड और यह ऐसी है कि ऊतक और स्लाइड एक 45 डिग्री के कोण पर चेहरा नीचे और मोटे तौर पर कर रहे हैं मीडिया के एक जलाशय में सूई द्वारा Vetbond ™ इलाज ऊतक एक कोण पर उल्टा होल्डिंग उजागर ऊतक सतह पर इलाज से अधिक गोंद को रोकने में मदद करता है. ऊतक की सतह पर गोंद (चित्रा 6) लेजर रोकेंगे.

    Figure_6.jpg
    चित्रा 6. Vetbond ऊतक glu इलाजमीडिया में सूई द्वारा ई

    नोट: चरण 2-5 मास्टर करने के लिए थोड़ा अभ्यास ले सकते हैं . पहली बार के लिए प्रयास करने से पहले त्याग या अतिरिक्त ऊतक के टुकड़े के साथ अभ्यास करने का प्रयास करें.

  6. थपका स्लाइड के नीचे पर एक सिलिकॉन तेल की एक छोटी राशि.

  7. छिड़काव कक्ष में स्लाइड रखें. सुनिश्चित करें कि छिड़काव मीडिया बह रही है, 37 डिग्री सेल्सियस और ऊतकों को जोड़ने से पहले oxygenated. धीरे स्लाइड छिड़काव कक्ष के नीचे और प्लास्टिक कवर पर्ची के बीच सिलिकॉन तेल के साथ एक मुहर बनाने के किनारों पर नीचे दबाएँ.

III. दो - फोटॉन इमेजिंग

  1. उज्ज्वल क्षेत्र प्रेषित प्रकाश का प्रयोग, ऊतक के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित. रोशनी के सभी मुड़ें.

  2. लेजर चालू करें, के रूप में अपने बहु - फोटोन खुर्दबीन प्रणाली द्वारा आवश्यक PMTs.

  3. अत्यधिक आदेश दिया तंतुमय प्रोटीन में दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) (कोलेजन और मायोसिन) उत्तेजना लेजर के आधा तरंग दैर्ध्य में एक संकेत पैदा करता है. हम 900 एनएम पर उत्तेजना का उपयोग करते हैं, 450 एनएम जो माइक्रोस्कोप के "नीले" चैनल का उपयोग visualized किया जा सकता एसएचजी के लिए अग्रणी. एसएचजी पीढ़ी एक गैर रेखीय प्रक्रिया (दो photon) है, और इस प्रकार एक ऑप्टिकल "सेक्शनिंग" प्रतिदीप्ति के दो photon उत्तेजना के समान प्रभाव प्रदान करता है. एसएचजी की चोटी दक्षता होती है जब तंतुओं लेजर के लिए सीधा कर रहे हैं, जबकि तंतुओं कि समानांतर में चलाने की कल्पना नहीं किया जाएगा 1.

  4. कोशिकाओं के बहुत सारे के साथ एक अच्छा इमेजिंग क्षेत्र का पता लगाएँ, अपने अधिग्रहण ऐसे क्षेत्र है कि कोशिकाओं के बहुमत केंद्र में हैं और इमेजिंग शुरू सेट. नोट: डीटीएच प्रतिक्रियाओं में, टी कोशिकाओं और अन्य सेल पैठ अक्सर एक साथ ध्यान केंद्रित किया है, जबकि अन्य क्षेत्रों 2 कोशिकाओं घुसपैठ से रहित कर रहे हैं पाए जाते हैं. इसलिए, यह कुछ समय लेने के ऊतक खोज करने के लिए छवि के लिए सबसे अच्छा क्षेत्र को मिल सकता है.

  5. इमेजिंग के दौरान सेल वेग और polarity का आकलन करके सेल व्यवहार्यता के लिए जाँच करें. सबसे कम लेजर शक्ति है कि न्यूनतम तस्वीर क्षति सुनिश्चित करने के लिए स्वीकार्य छवि गुणवत्ता प्रदान करता है का उपयोग करें.

  6. एक नए ऊतक के रूप में की जरूरत तैयारी में स्वैप.

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References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

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