التصوير T الذاكرة المستجيب الخلايا في الأذن بعد تحريض DTH بالتبني

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

نحن هنا يبرهن على وجود طريقة لحمل وتسجيل التقدم المحرز في رد فعل متأخر (DTH) نوع فرط في الأذن الفئران. اعقب ذلك عرض لإعداد الأنسجة الأذن الفئران لتصوير ثنائي الفوتون من المستجيب / الذاكرة استجابة الخلايا التائية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تأخر فرط نوع (DTH) هو رد الفعل المناعي الذي اللاعبين الرئيسيين هم CCR7 -- المستجيب / اللمفاويات التائية الذاكرة. هنا ، علينا أن نظهر وسيلة لحفز التقدم وتسجيل ردود فعل من البيوت في الأذن الفئران. اعقب ذلك عرض لإعداد الأنسجة الأذن الفئران لتصوير اثنين من الفوتون CCR7 -- المستجيب / الذاكرة استجابة الخلايا التائية.

هو أحد البيوت التي يسببها بالتبني من قبل حقن داخل الصفاق من GFP المسمى البويضات محددة CCR7 -- المستجيب / الذاكرة خط الخلايا التائية (Beeton ، C J. التجارب متصور ، العدد 8). ثم يتم السماح للتوازن الخلايا في الفئران لمدة 48 ساعة قبل التحدي عن طريق حقن أذن واحدة مع المياه المالحة (مراقبة الأذن) ، والآخر مع مزيج من مترافق 01:01 البويضات والبويضات الى تكساس الأحمر (OVA - TR) للسماح التصور الخلايا مستضد تقديم المقيمين.

نحن تصف طريقة لإعداد الأنسجة مفيدة لتصوير حركية من خلايا داخل طبقة الجلد العميقة خلال استجابة مناعية ، بالاشتراك مع التصور من ألياف الكولاجين التي التوافقي الجيل الثاني. يتم قطع نسيج الأذن إلى 5 مم X المربعات 5 (أكبر قليلا هو أفضل) والتي شنت على غطاء بلاستيكي باستخدام قسائم Vetbond ™ ، والتي يتم تأمينها ثم استخدام الشحوم سيليكون في غرفة التصوير وsuperfused بواسطة الأكسجين فقاعات نسيج الثقافة في المتوسط ​​37 درجة مئوية .

Protocol

تحريض DTH بالتبني

الرجاء راجع المقالة إن الرب : الاستقراء والرصد من فرط الحساسية المتأخرة نوع بالتبني في الفئران
كريستين Beeton جورج ك. شاندي
قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية في جامعة كاليفورنيا في ايرفين
تجارب J. متصور ، العدد 8

هنا ، ونحن قد عدلت هذا البروتوكول باستخدام المستضد (Ovalbumin) مترافق الى تكساس الأحمر في نسبة 1:1 مع مستضد غير المسماة للسماح التصور من الخلايا البلعمية مستضد تقديم.

الأذن الأنسجة الحصاد

  1. الموت ببطء والفئران عند نقطة في الوقت المطلوب عن طريق الإجراءات المحددة في البروتوكول الخاص الحيوانية المعتمدة. هنا ، فإننا نستخدم جرعة زائدة من المخدر ، isoflurane. يتم ذلك في حاوية مغلقة تقع داخل غطاء جيد التهوية. ضمان للحيوان ميت إما قطع الرأس من خلال فتح التجويف الصدري وقطع القلب.

  2. باستخدام مقص كبير إزالة قطع الأذن مع واحد ، على مقربة من جسم الحيوان قدر الإمكان (الشكل 1).

    Figure_1.jpg
    الشكل 1. إزالة الأذن الفئران

  3. مكان الأذن في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على ~ 10 مل من 1X PBS الجليد الباردة أو RPMI 1640. الحفاظ على عينات الأنسجة على الجليد حتى تكون على استعداد لتحضير لتصوير الأنسجة.

  4. صورة الأنسجة في أقرب وقت ممكن ، ونحن نجد ، على الرغم من أن 1 إلى 2 ساعة على الجليد ليس له تأثير ملحوظ على حركية الخلية في الأنسجة عند مقارنة النسيج المقطوع والتقط على الفور.

التحضير لتصوير الأنسجة

أولا إزالة طبقة البشرة والجلد

* ملاحظة : يجب أن تبقى طبقة الجلد العميقة سليمة. إذا كان القيام به بشكل صحيح سوف الأوعية الدموية الكبيرة لا تزال سليمة وسوف لا يتعرض الغضروف في الأذن يكون. هذا هو أسلوب صعب ، وخصوصا عندما لا يوجد التهاب (شروط المراقبة) وانه من المفيد استخدام مجهر تشريح.

  1. مكان كل من الأنسجة وسائل الإعلام من الأنبوب المخروطية في صحن 10 سم زراعة الأنسجة.

  2. مع الاستمرار على أيدي القفاز الأذن الفئران بلطف على طرف الأذن (البعيدة) مع الجانب الظهري من الأذن مواجهة (الشكل 2).

    Figure_2.jpg
    الشكل 2. تقليم الفراء قبالة الأذن

  3. مع إبهامك على أعلى الأذن ، والنسيج ثابتة أثناء استخدام غيض من دومون مغلقة # 5 المقص لفصل الأدمة العميقة من الأدمة. بدلا من ذلك ، إذا كان على حافة الأذن لديها فائض من الجلد / الأدمة العميقة ، يمكن اغتنامها هذا مع ملقط وسحبت بلطف لفصل هذه الأنسجة من تحت (الشكل 3).

    Figure_3.jpg
    الشكل 3. إزالة الأدمة العليا

  4. مرة واحدة وقد تم فصل منطقة صغيرة من الجلد من الأنسجة الكامنة ، كرر الخطوات بدلا من الانفصال باستخدام مقص لقطع بين طبقات الجلد وملقط لإزالة بلطف وتقشر الجلد فكها.

  5. تكشف النقاب عن 5 × 5 ملم أو مساحة أكبر من أنسجة الأذن التي لا تقل عن 3 ملم من موقع الأولي لحقن المستضد (الشكل 4).

    Figure_4.jpg
    الشكل 4. الأنسجة تتعرض للتصوير

II. تأمين الأنسجة إلى مرحلة التصوير

  1. قطع من البلاستيك لتغطية زلة حجم أكبر قليلا من نسيج المعدة.

  2. انتشار طبقة رقيقة من نسيج Vetbond 3M ™ آمنة الغراء عبر الشريحة.

  3. فهم ركن من نسيج المعدة (حيث كنت من غير المحتمل أن الصورة) ، وترفع من وسائل الإعلام ، وربت الجانب السفلي من الأنسجة على الورق أو عدسة كيم مسح وسائل الإعلام لإزالة الزائدة.

  4. لمس حافة الأنسجة لتغطية الشريحة الغراء (ويشفي Vetbond فورا على النسيج الرطب). تمتد برفق الأنسجة شقة ، مع الطرف المقابل هو آخر من لمس الشريحة (الشكل 5)

    Figure_5.jpg
    الشكل 5. جبل نسيج لتغطية زلة

  5. علاج ™ Vetbond بواسطة قلب النسيج عينة / الانزلاق والغمس في خزان من وسائل الاعلام ان هذه الشريحة والنسيج وجهه لأسفل وتقريبا بزاوية 45 درجة. عقد النسيج رأسا على عقب في زاوية يساعد على منع الغراء الزائد من على سطح علاج الأنسجة المكشوفة. والغراء على سطح النسيج كتلة ليزر (الشكل 6).

    Figure_6.jpg
    الشكل 6. شفاء الأنسجة vetbond حمض الغلوتاميكه عن طريق غمس في وسائل الإعلام

    ملاحظة : خطوات 02-05 مايو يأخذ القليل من الممارسة لاتقان. حاول ممارسة القطع مع تجاهل أو الأنسجة الزائدة قبل محاولة للمرة الأولى.

  6. ربت على كمية صغيرة من السيليكون الشحوم على الجزء السفلي من الشريحة.

  7. ضع الشريحة في غرفة الارواء. تأكد من أن وسائل الإعلام نضح تتدفق ، و 37 درجة مئوية ، والاوكسيجين قبل ان يضيف الأنسجة. اضغط برفق لأسفل على حواف الشريحة صنع ختم الشحوم مع السيليكون بين الجزء السفلي من الغرفة ، ونضح زلة غطاء من البلاستيك.

III. ثنائي الفوتون التصوير

  1. استخدام الضوء الساطع مجال المنقولة ، والتركيز على الجزء العلوي من الأنسجة. إيقاف كل الاضواء.

  2. بدوره على الليزر ، وهذه الفرق على النحو المطلوب من قبل النظام الخاص مجهر متعدد الفوتون.

  3. الجيل الثاني التوافقي (SHG) في البروتينات الليفية عالية أمر (الكولاجين والميوسين) تنتج إشارة في الطول الموجي النصف من الليزر الإثارة. نستخدم الإثارة في 900 نانومتر ، مما أدى إلى SHG عند 450 نانومتر التي يمكن تصور استخدام "الزرقاء" قناة المجهر. SHG جيل هو غير الخطية (ثنائي الفوتون) عملية ، ويوفر بالتالي البصرية "sectioning" تأثير مماثل لذلك من الإثارة اثنين من الفوتون مضان. كفاءة ذروة SHG يحدث عندما يتم ييفات عمودي على الليزر ، في حين أن الألياف تعمل في موازاة ذلك لا يمكن تصور 1

  4. موقع التصوير في منطقة جيدة مع الكثير من الخلايا ، وتعيين منطقتك اقتناء مثل هذه الغالبية من الخلايا الموجودة في المركز وبدء التصوير. ملاحظة : في ردود الفعل المباشرة الى البيوت ، وكثيرا ما توجد الخلايا التائية والخلايا الأخرى تتسرب إلى التركز معا بينما مناطق أخرى خالية من التسلل الى الخلايا 2. لذلك ، قد يستغرق بعض الوقت في البحث في النسيج للعثور على أفضل صورة للمنطقة.

  5. الاختيار لبقاء الخلية من خلال تقييم سرعة الخلية والاقطاب خلال التصوير. استخدام قوة أقل الليزر الذي يوفر جودة الصورة مقبولة لضمان الحد الأدنى من الصور والضرر.

  6. مبادلة في إعداد أنسجة جديدة حسب الحاجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics