養子DTHの誘導後の耳のイメージングエフェクターメモリーT細胞

Biology

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Summary

ここでは、ラットの耳で遅延型-過敏(DTH)反応の進行を誘導し、記録するための方法を示しています。これは、エフェクター/メモリーT細胞応答の二光子イメージング用ラットの耳組織の準備のデモが続いている。

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Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

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Abstract

エフェクター/メモリーTリンパ球-遅延型過敏症(DTH)は、メインプレイヤーがCCR7される免疫反応です。ここで、我々は、ラットの耳にDTH反応の進行を誘導し、記録するための方法を示しています。エフェクター/メモリーT細胞応答-これは、CCR7の二光子励起イメージング用ラットの耳組織の準備のデモが続いている。

エフェクター/メモリーT細胞株(ビートン、C J.可視化実験、第8号) -養子DTHは、GFPで標識したOVA特異的CCR7の腹腔内注射により誘導される。次に、細胞を可視化を可能にするためにテキサスレッドの卵子と卵子共役の1:1混合(OVA - TR)と生理食塩水(対照耳)ともう片方の耳を注入することにより、チャレンジの48時間前のためにラットで平衡化されている常駐抗原提示細胞の。

我々は第二高調波発生によるコラーゲン線維の可視化と組み合わせて、イメージングのための有用な組織調製の方法免疫応答の間に深い真皮層内の細胞の運動性を説明。耳の組織は、5 × 5mmの正方形(少し大きめが良い)に切断し、その後37℃でのイメージングチャンバー内にシリコーングリースを使用して保護し、酸素バブリング組織培養培地で灌流されているVetbond™を使用してプラスチック製のカバースリップ、上にマウントされています° C 。

Protocol

養子DTHの誘導

Joveの資料を参照してくださいラットにおける養子遅延型過敏症の誘導とモニタリング
クリスティンビートン、ジョージK. Chandy
生理学と生物物理学専攻、カリフォルニア大学アーバイン校
J.可視化実験、第8号

ここで、我々は、貪食抗原提示細胞の可視化を可能にするために非標識抗原と1:1の比率で抗原(卵白アルブミン)テキサスレッドコンジュゲートさを使用して、このプロトコルを変更しました。

耳組織の収穫

  1. あなたの承認された動物のプロトコルに記載されている手順で、目的の時間の時点でラットを安楽死させる。ここでは、イソフルラン麻酔薬の過剰摂取を、使用してください。これは、よく換気フード内にある密閉容器内で行われます。動物は、胸腔を開いて心臓を切断することによってのいずれかの斬首によって死んでいることを確認します。

  2. 大きなハサミを使用すると、可能な限り動物の体に近づけるシングルカット、(図1)で耳を取り外します。

    Figure_1.jpg
    図1。ラットの耳の除去

  3. 氷冷した1 × PBSまたはRPMI - 1640の約10 mlを入れた15 mlコニカルチューブに耳を置きます。あなたがイメージングのために組織を準備する準備が整うまで、氷上に組織サンプルを保管してください。

  4. できるだけ早く画像組織、我々は、収穫し、すぐに画像化組織と比較した場合、氷上で1〜2時間は、組織の細胞の運動性には目に見える効果がないこと、しかし、見つける。

イメージングのための組織の準備

表皮と真皮層のI.除去

*注意 :深い真皮層はそのまま保持されている必要があります。正しく行えば、大きな血管が損なわれることと耳の軟骨は公開されません。は炎症(コントロール条件)がない場合は特にこれは、難しいテクニックであり、それは解剖顕微鏡を使用すると便利です。

  1. 10cmの組織培養皿の円錐管から組織とメディアの両方を置きます。

  2. 手袋をはめた手では(図2)を上に向けて耳の背側と耳(遠位)の先端に軽くラットの耳をホールドして。

    Figure_2.jpg
    図2。耳オフトリム毛皮

  3. 深い真皮から真皮を分離するために、閉じたデュモン#5はさみの先端を使用しながら、耳の上、安定した組織で、親指で。また、耳の端が皮膚/深い真皮のオーバーハングを持つ場合、これはピンセットで把握することができ、ゆっくりと組織の下にある(図3)からこれを分離するために引っ張った。

    Figure_3.jpg
    図3。真皮上層の除去

  4. 一度、皮膚の小さな領域が交互に優しく除去し、外れた皮膚を剥がしに真皮層と鉗子の間でカットするはさみを使って分離の手順を繰り返します、下にある組織から分離されています。

  5. 5 × 5 mmまたは抗原の注射の最初の部位(図4)から少なくとも3 mmである耳組織の大きな面積を公開しています。

    Figure_4.jpg
    図4。イメージングに曝露された組織

II。イメージングのステージに組織を保護

  1. 準備組織よりも少し大きいサイズのプラスチック製カバースリップをカット。

  2. 3M Vetbondスライド全体™組織セーフ接着剤の薄層を広げる。

  3. レンズの紙やキムの組織の下側、準備組織の隅をつかみ(あなたがイメージする可能性がない場合)、メディアから削除し、DABは、余分なメディアを削除するに拭いてください。

  4. 接着剤カバーしたスライド(すぐにウェットティッシュでVetbond治療法)に組織の端をタッチ。ゆっくりと(図5)スライドに触れないように最後は反対側で、フラットな組織を伸ばす

    Figure_5.jpg
    図5。スリップをカバーするために組織をマウントします。

  5. 反転組織サンプルでVetbond™を治す/スライドと組織とスライドは、45度の角度でダウンとほぼ直面しているように、メディアの貯水池に浸漬。角度を上下逆さまに組織を保持すると、曝露された組織の表面に硬化から余分な接着剤を防ぐことができます。組織の表面上に接着剤は、レーザー(図6)をブロックします。

    Figure_6.jpg
    図6。 vetbond組織GLUを治すメディアに浸漬することによって、電子

    :ステップ2-5は、マスターに少し練習がかかる場合があります。初めて試みる前に破棄または余分な組織片で練習してみてください。

  6. DABスライドの底にシリコングリスを少量。

  7. 灌流チャンバ内のスライドを置きます。灌流のメディアは、37 ° Cを流れると組織を追加する前に酸素をされていることを確認します。ゆっくりと灌流チャンバーの底部とプラスチック製のカバーガラスの間にシリコングリスでシールを作るスライドの端を押し下げます。

III。二光子イメージング

  1. 明視野透過光を使用して、組織の上に焦点を当てる。ライトのすべての電源を切ります。

  2. 、レーザーのようにして多光子顕微鏡のシステムで必要とされる光電子増倍管を入れます。

  3. 高秩序の繊維状タンパク質で第二高調波発生(SHG)(コラーゲンおよびミオシン)は、励起レーザーの半波長の信号を生成する。我々は、顕微鏡の"青"のチャンネルを使って視覚化できる450 nmでSHGにつながる、900nmの励起を使用してください。世代のSHGと非線形(二光子)のプロセスであるので、蛍光の二光子励起の場合と同様の光学"切片"の効果を提供します。並列で実行される線維が可視化されることはありませんが、SHGのピーク効率は、線維がレーザーに対して垂直になるときに発生します1。

  4. 細胞をたっぷり使って良好な結像領域を見つけ、細胞の大部分が中央にあり、イメージングを開始するようにして取得面積を設定します。注:DTH反応では、T細胞および他の細胞浸潤はしばしば他の領域は、セル2の浸潤性を欠いている間に一緒に集中して発見された。そのため、画像への最適な領域を見つけるために組織を検索し、時間がかかることがあります。

  5. 撮像中にセルの速度と極性を評価することにより細胞の生存を確認してください。最小限の写真 - ダメージを確保するために許容可能な画質を提供する最小のレーザパワーを使用してください。

  6. 必要に応じて新しい組織の準備のために交換する。

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References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

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