Imaging Effector cellule T di memoria nell'orecchio dopo l'induzione di DTH adottivi

Biology

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Summary

Qui mostriamo un metodo per indurre la registrazione e il progresso di una ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) reazione nell'orecchio ratto. Questa è seguita da una dimostrazione della preparazione di tessuto di ratto orecchio per l'imaging a due fotoni del effettrici / risposta delle cellule T memoria.

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Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

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Abstract

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione immunitaria in cui i protagonisti sono CCR7 - effettrici / linfociti T memoria. Qui, dimostriamo un metodo per indurre il progresso e la registrazione di una reazione DTH nell'orecchio ratto. Questa è seguita da una dimostrazione della preparazione di tessuto di ratto orecchio per l'imaging a due fotoni del CCR7 - effettrici / risposta delle cellule T memoria.

Un DTH adottiva è indotta dalla iniezione intraperitoneale di GFP-etichettata Ova-specifiche CCR7 - effettrici / memoria linea cellulare T (Beeton, C J. Esperimenti Visualized, numero 8). Le cellule sono poi lasciato equilibrare nel ratto per 48 ore prima sfida, iniettando un orecchio con soluzione salina (controllo orecchio) e l'altro con una miscela 1:1 di coniugati Ova e Ova a Texas-Red (Ova-TR) per consentire la visualizzazione residente di cellule presentanti l'antigene.

Descriviamo un metodo di preparazione dei tessuti utili per l'imaging la motilità delle cellule all'interno dello strato dermico profondo durante una risposta immunitaria, in collaborazione con visualizzazione delle fibre di collagene da generazione di seconda armonica. Il tessuto viene tagliato l'orecchio in 5 x 5 millimetri quadrati (leggermente più grande è meglio), montato su slitta copertura in plastica con Vetbond ™, che sono poi protetti con grasso al silicone in una camera di imaging e superfused da ossigeno-bolle terreni di coltura a 37 ° C .

Protocol

Induzione di DTH adottivi

Si prega di consultare l'articolo jove: induzione e monitoraggio del adottivi ipersensibilità ritardata nei ratti
Christine Beeton, George K. Chandy
Dipartimento di Fisiologia e Biofisica, University of California, Irvine
Esperimenti J. visualizzati, Numero 8

Qui, abbiamo modificato questo protocollo usando antigene (ovoalbumina), coniugata con Texas-Red in un rapporto 1:1 con l'antigene senza etichetta per consentire la visualizzazione di fagocitaria cellule presentanti l'antigene.

Orecchio tessuto Harvest

  1. Euthanize il ratto al momento desiderato-punto per le procedure descritte nel protocollo animali approvato. Qui, usiamo una dose eccessiva di anestetico, isoflurano. Questo viene fatto in un contenitore chiuso all'interno di una cappa ben ventilata. Assicurarsi che l'animale è morto da una decapitazione del aprendo la cavità toracica e tagliando il cuore.

  2. Utilizzando le forbici grandi rimuovere l'orecchio con un unico taglio, più vicino al corpo dell'animale possibile (Figura 1).

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    Figura 1. La rimozione dell'orecchio ratto

  3. Posizionare l'orecchio in un tubo da 15 ml contenente circa 10 ml di ghiacciata 1x PBS o RPMI-1640. Mantenere i campioni di tessuto sul ghiaccio fino al momento di preparare il tessuto per l'imaging.

  4. L'immagine del tessuto il più presto possibile, troviamo, però, che 1 o 2 ore sul ghiaccio non ha alcun effetto distinguibile sulla motilità delle cellule nei tessuti rispetto al tessuto raccolto e ripreso immediatamente.

Preparazione dei tessuti per l'imaging

Rimozione I. strato epidermico e dermico

* Nota: Lo strato dermico profondo deve essere mantenuta intatta. Se fatto correttamente grandi vasi sanguigni rimarrà intatto e la cartilagine dell'orecchio non saranno esposti. Questa è una tecnica difficile, soprattutto quando non c'è l'infiammazione (condizioni di controllo) ed è utile usare un microscopio da dissezione.

  1. Luogo sia il tessuto e dei media dal tubo conico in un piatto di coltura di tessuti 10 cm.

  2. Con le mani guantate tenere l'orecchio ratto delicatamente sulla punta dell'orecchio (distale) con la parte dorsale del l'orecchio rivolto verso l'alto (Figura 2).

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    Figura 2. Pelliccia tagliare l'orecchio

  3. Con il pollice sulla parte superiore dell'orecchio, stabile il tessuto mentre si usa la punta di chiusura Dumont # 5 forbici per separare il derma dal derma profondo. In alternativa, se il bordo del padiglione auricolare ha una sporgenza della pelle / derma profondo, questo può essere afferrato con una pinza e delicatamente tirato a separare questo dal tessuto sottostante (Figura 3).

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    Figura 3. La rimozione del derma superiore

  4. Una volta che una piccola zona di pelle è stata separata dal tessuto sottostante, ripetere la procedura di separazione in alternativa usare le forbici per tagliare tra gli strati del derma e pinze per rimuovere delicatamente e rimuovere la pelle sloggiato.

  5. Esporre un 5 x 5 mm o maggiore superficie di tessuto orecchio che è di almeno 3 mm dal sito iniziale di iniezione antigene (Figura 4).

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    Figura 4. Tessuti esposti per l'imaging

II. Protezione del tessuto allo stage Imaging

  1. Tagliare un pezzo di plastica di copertura a una dimensione leggermente più grande rispetto al tessuto preparato.

  2. Stendere uno strato sottile di 3M ™ Vetbond tessuto-safe colla tutta la diapositiva.

  3. Afferrare l'angolo del tessuto preparato (dove non sono suscettibili di immagine), rimuovere dai media, e tamponare la parte inferiore del tessuto su carta lenti o Kym pulire per rimuovere il supporto in eccesso.

  4. Toccare il bordo del tessuto alla diapositiva colla coperto (le cure Vetbond immediatamente sul tessuto bagnato). Tratto delicatamente il tessuto piatto, con l'estremità opposta è l'ultimo a toccare la diapositiva (Figura 5)

    Figure_5.jpg
    Figura 5. Monte dei tessuti per fodera

  5. Curare l'™ Vetbond invertendo il campione di tessuto / slide e immersione in un serbatoio di media in modo tale che il tessuto e far scorrere sono a faccia in giù e più o meno ad un angolo di 45 gradi. Tenendo premuto il tessuto a testa in giù in un angolo aiuta a prevenire la colla in eccesso da curare sulla superficie del tessuto esposto. Colla sulla superficie del tessuto blocca il laser (Figura 6).

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    Figura 6. Cure vetbond tessuto glue per immersione nei media

    Nota: 2-5 passaggi possono prendere un po 'di pratica per padroneggiare. Prova pratica con pezzi di tessuto scartati o più prima di provare per la prima volta.

  6. Tamponare una piccola quantità di grasso al silicone sul fondo della diapositiva.

  7. Mettere il vetrino nella camera di perfusione. Assicurarsi che il supporto perfusione è scorrevole, 37 ° C e ossigenata prima di aggiungere dei tessuti. Premere delicatamente sul bordo del vetrino fare un sigillo con il grasso al silicone tra il fondo della camera di perfusione e la polizza di copertura in plastica.

III. Due-Photon Imaging

  1. Utilizzando campo chiaro luce trasmessa, messa a fuoco sulla parte superiore del tessuto. Spegnere tutte le luci.

  2. Accendere il laser, PMT, come richiesto dal sistema multi-fotone microscopio.

  3. Generazione di seconda armonica (SHG) in altamente ordinato proteine ​​fibrose (collagene e miosina) produce un segnale a metà della lunghezza d'onda del laser di eccitazione. Noi usiamo eccitazione a 900 nm, portando a SHG a 450 nm che può essere visualizzato utilizzando il canale "blu" del microscopio. SHG generazione è un non-lineare (a due fotoni) di processo, e fornisce quindi un effetto ottico "sezionare" simile a quella di eccitazione a due fotoni di fluorescenza. L'efficienza di picco di SHG si verifica quando le fibrille sono perpendicolari al laser, mentre le fibrille che corrono in parallelo non verrà visualizzato 1.

  4. Individuare una buona zona di imaging con abbondanza di celle, impostare l'area di tale acquisizione che la maggior parte delle cellule si trovano nel centro e iniziare imaging. Nota: Nelle reazioni DTH, le cellule T e cellule infiltrati altri si trovano spesso a concentrarsi insieme mentre altre zone sono prive di infiltrare cellule 2. Pertanto, si può richiedere un certo tempo a cercare i tessuti per trovare la zona migliore per immagine.

  5. Verificare la presenza di vitalità cellulare, valutando la velocità e la polarità delle cellule durante l'imaging. Utilizzare il minor potenza laser che offre una qualità dell'immagine accettabile per garantire la minima foto-danni.

  6. Swap in un preparato nuovo tessuto, se necessario.

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References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

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