Kabul edilmiş DTH indüksiyonu sonra Kulak Görüntüleme Efektör Bellek T hücreleri

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Burada uyaran ve sıçan kulak gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) reaksiyon ilerleme kaydetmek için bir yöntem gösteriyor. Bu sıçan kulak doku hazırlanması / bellek efektör T hücre yanıtının iki foton görüntüleme için bir gösteri izledi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Efektör / bellek T lenfositleri - Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH), ana oyuncuları CCR7 olan bir bağışıklık reaksiyonu . Burada, uyaran ve sıçan kulakta bir DTH reaksiyon ilerleme kaydetmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Efektör / bellek T hücre yanıtı - Bu sıçan kulak doku hazırlanması CCR7 iki foton görüntüleme için bir gösteri izledi.

Efektör / bellek T hücre hattı (Beeton, C J. görüntülenmiştir deneyler, Sayı: 8) - Bir evlat edinen DTH GFP etiketli Ova özel CCR7 intraperitoneal enjeksiyonu ile indüklenen. Hücreler daha sonra 48 saat önce meydan görselleştirme izin Texas-Kırmızı Ova ve Ova konjuge 1:1 karışımlar (Ova-TR) ile serum fizyolojik (kontrol kulak) ve diğer bir kulak enjekte sıçan denge sağlaması için izin verilir yerleşik antijen-sunan hücreler.

Biz bir görüntüleme motilite bir immün yanıt sırasında, ikinci harmonik üretimi, kolajen liflerinin görselleştirme ile birlikte derin dermal tabaka içinde hücreler için yararlı doku hazırlanması yöntemi açıklanmaktadır. Kulak doku 5 x 5 mm kareler (biraz daha büyük daha iyidir) oyulmuş ve sonra 37 görüntüleme odasında silikon gres kullanılarak güvenli ve oksijen kabarmış doku kültürü ortamı superfused Vetbond ™ kullanarak plastik kapak bordroları monte ° C .

Protocol

Kabul edilmiş DTH indüksiyonu

İndüksiyon ve İzleme Lütfen vallahi makalesine bakın: Sıçanlarda Kabul edilmiş Gecikmeli-Tipi aşırı duyarlılık
Christine Beeton George K. Chandy
Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü, University of California, Irvine
J. görüntülenmiştir Deneyler, Sayı 8

Burada, bu protokol fagositik antijen-sunan hücreler görünüm için izin etiketsiz antijen ile 1:1 oranında antijen (ovalbumin) Texas-Kırmızı konjuge kullanarak modifiye ettiler.

Kulak Doku Hasat

  1. İstediğiniz zaman noktada onaylanmış hayvan protokolde belirtilen usul ile sıçan Euthanize. Burada, aşırı dozda anestezi, izofluran kullanın. Bu, iyi havalandırılmış bir kaput içinde bulunan kapalı bir kap içinde yapılır. Hayvan torasik kavite açılması ve kalp kesim ya dekapitasyon ölü olduğundan emin olun.

  2. Büyük makas kullanarak hayvanın vücuduna mümkün olduğu kadar yakın tek bir kesim, (Şekil 1) kulak çıkarın.

    Figure_1.jpg
    Şekil 1. Rat kulak kaldırılması

  3. Içeren bir buz 1x PBS veya RPMI-1640 ~ 10 ml 15 ml konik tüp kulak yerleştirin. Buz üzerinde doku örnekleri doku görüntüleme hazırlamak için hazır olana kadar tutun.

  4. Mümkün olduğunca çabuk Görüntü doku, hasat ve anında görüntülü doku göre 1 ila 2 saat buz üzerinde doku, hücre hareketi üzerinde belirgin bir etkisi olduğunu, ancak, bulabilirsiniz.

Görüntüleme için Doku Hazırlama

Epidermal ve dermal Katman I. Kaldırma

* Not: derin dermal tabaka sağlam tutulmalıdır. Eğer doğru yapılırsa büyük kan damarları kalacaktır ve kulak kıkırdak maruz kalmayacaktır. Herhangi bir inflamasyon (kontrol koşulları) var, özellikle bu zor bir tekniktir ve bir diseksiyon mikroskop kullanılması yararlı olur.

  1. 10 cm doku kültürü çanak konik tüp doku ve medya yerleştirin.

  2. Eldivenli eller, dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde (Şekil 2) kulak kulak (distal) ucuna hafifçe sıçan kulak tutun ile.

    Figure_2.jpg
    Şekil 2. Kulak keserek kürk

  3. Kulak üst, derin dermis dermis ayrı ucu kapalı Dumont # 5 makas kullanırken sabit doku başparmak ile. Alternatif olarak, kulak kenarı deri / derin dermis bir çıkıntı varsa, bu forseps ile kavradı ve yavaşça altındaki doku (Şekil 3) ayrı çekti.

    Figure_3.jpg
    Şekil 3. Üst dermis kaldırılması

  4. Bir kez cilt küçük bir alanda alternatif hafifçe kaldırın ve yerinden deri soyulabilir, dermal katmanlar ve forseps arasında kesmek için makas kullanarak ayırma adımları tekrarlayın, altta yatan doku ayrılmış oldu.

  5. 5 x 5 mm veya kulak doku antijen enjeksiyonu ilk site (Şekil 4) en az 3 mm daha geniş bir alana Açığa.

    Figure_4.jpg
    Şekil 4. Görüntüleme için maruz Doku

II. Görüntüleme Sahne Doku güvenliğini

  1. Plastik bir kapak kayma hazırlanan doku biraz daha büyük bir boyuta kesin.

  2. 3M Vetbond ™ slaytta doku güvenli yapıştırıcı ince bir tabaka halinde sürün.

  3. Hazırlanan doku (görüntü muhtemel değildir) köşesinde tutun, medya kaldırmak ve dab doku, lens kağıt veya Kym üzerinde alt aşırı medya kaldırmak için silin.

  4. Tutkal kapalı slayt (ıslak mendil hemen Vetbond kürleri) doku kenarına dokunun. (Şekil 5) slayt dokunmak için son olan diğer ucunu nazikçe, düz doku germek

    Figure_5.jpg
    Şekil 5. Kayma kapsayacak şekilde doku Dağı

  5. Cure Vetbond ™ tersine doku örneği / slayt ve daldırma, doku ve slayt yüzü aşağı ve aşağı yukarı 45 derecelik bir açıda olduğu gibi medya bir rezervuar. Ters bir açıyla Holding doku maruz kalan doku yüzey kür fazla tutkal önlemek için yardımcı olur. Tutkal doku yüzeyine lazer engeller (Şekil 6).

    Figure_6.jpg
    Şekil 6. Vetbond doku glu CureMedyada daldırma e

    Not: Adımlar 2-5 master için biraz pratik gerektirebilir. Ilk kez denemeden önce atılır veya ekstra doku parçaları ile pratik deneyin.

  6. Dab üzerine silikon gres slayt altındaki küçük bir miktar.

  7. Perfüzyon odasında slayt yerleştirin. Perfüzyon medya, 37 ° C akan ve doku eklemeden önce oksijenli olduğundan emin olun. Perfüzyon odasının alt ve plastik kapak kayma arasında silikon gres yağı ile bir mühür slayt kenarlarını hafifçe bastırın.

III. İki-Foton Görüntüleme

  1. Parlak alan iletilen ışık kullanarak, doku üstüne odaklanır. Tüm ışıkları kapatın.

  2. Lazer açın, çok foton mikroskop sistemi tarafından gerekli Proje Yönetim Ekipleri.

  3. Ikinci harmonik üretimi, yüksek emretti lifli proteinler (SHG) (kolajen ve miyozin) ikaz lazer yarım dalga boyunda bir sinyal üretir. Mikroskop "mavi" kanalını kullanarak görüntülenebilmekte 450 nm'de SHG önde gelen 900 nM uyarma kullanın. SHG nesil bir non-lineer (iki-foton) işlemi ve bu nedenle floresan iki foton uyarma benzer bir optik "Kesit" etkisi sağlar. Paralel olarak çalışan fibriller görüntülenmiştir izin vermeyecek SHG tepe verimliliği, fibriller lazer dik oluşur. 1

  4. Bol hücre ile iyi bir görüntüleme alanı bulun hücrelerin çoğunluğunun merkezi ve görüntüleme başlar, satın alma alanı ayarlayın. Not: DTH reaksiyonlar, T hücreleri ve diğer hücre infiltrasyonlar sıklıkla, diğer alanlarda hücreler 2 infiltre yoksun ise birlikte konsantre olarak bulunmuştur . Bu nedenle, doku görüntü için en uygun alanı bulmak için arama biraz zaman alabilir.

  5. Görüntüleme sırasında hücre hızı ve polarite değerlendirerek hücre canlılığı için kontrol edin. Minimal fotoğraf zarar görmesini sağlamak için kabul edilebilir bir görüntü kalitesi sağlayan en düşük lazer gücü kullanın.

  6. Yeni bir doku hazırlanması gerektiği gibi değiştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics