Metylerat DNA Immunoprecipitation

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Denna video visar protokollet för metylerade DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP är en två dagars förfarande som selektivt utdrag metylerade DNA-fragment från en genomisk DNA-prov med hjälp av antikroppar med specificitet för 5-methylcytosine (anti-5 MC).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Thu, K. L., Vucic, E. A., Kennett, J. Y., Heryet, C., Brown, C. J., Lam, W. L., Wilson, I. M. Methylated DNA Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (23), e935, doi:10.3791/935 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Identifieringen av mönstren DNA-metylering är ett vanligt förfarande i studiet av epigenetik, eftersom metylering är känt för att ha betydande effekter på genuttryck, och deltar med normal utveckling och sjukdomar

Protocol

DNA-extraktion och provberedning

DNA från en mängd olika prover (odlade celler, färskfrusen samt formalinfixerade paraffinförvarad vävnader) kan användas för MeDIP. Det är viktigt att använda renat DNA utan tillhörande proteiner såsom histoner. Det är också viktigt att ta bort så mycket RNA som möjligt från provet, eftersom det kan störa både DNA-kvantifiering och bindande antikroppar. Den mängd DNA används för MeDIP kan variera från 200 ng till 1 mikrogram beroende på mängden av DNA som finns. För att visa detta protokoll kommer 1 mikrogram av DNA användas. Följande protokoll kommer att tillhandahålla högkvalitativa dubbelsträngat DNA från odlade celler. Andra protokoll bör användas för extraktion av DNA från andra provtyper.

  1. Tillsätt 400 ìl av matsmältningen buffert till en cellpelleten i ett 1,7 ml Eppendorf-rör.
  2. Tillsätt 100 mikrogram proteinas K till röret, och inkubera över natten vid 50 ° C.
  3. Tillsätt 500 l fenol pH 7 och blanda försiktigt men grundligt genom att vända.
  4. Snurra på 13 000 g under 10 minuter vid rumstemperatur.
  5. Ta bort vattenlösning (överst) fraktionen till ett nytt rör.
  6. Upprepa steg 3 till 5 en gång.
  7. Tillsätt 500 l 01:01 fenol / kloroform pH 7 och blanda försiktigt men grundligt genom att vända.
  8. Snurra på 13 000 g under 10 minuter vid rumstemperatur.
  9. Ta bort vattenlösning (överst) fraktionen till ett nytt rör.
  10. Lägg till 40 mikrogram RNase A och inkubera 1 tim vid 37 ° C.
  11. Tillsätt 500 l fenol pH 7 och blanda försiktigt men grundligt genom att vända.
  12. Snurra på 13 000 g under 10 minuter vid rumstemperatur.
  13. Ta bort vattenlösning (överst) fraktionen till ett nytt rör.
  14. Upprepa steg 11 till 13 en gång.
  15. Tillsätt 500 l 01:01 fenol / kloroform pH 7 och blanda försiktigt men grundligt genom att vända.
  16. Snurra på 13 000 g under 10 minuter vid rumstemperatur.
  17. Ta bort vattenlösning (överst) fraktionen till ett nytt rör.
  18. Lägg 1/10th Volym 3 M natriumacetat (40 l) och blanda väl.
  19. Tillsätt 2 volymer (900 l) på 100% etanol, blanda väl och lägg vid -20 ° C i 20 minuter.
  20. Snurra på 13 000 g under 20 minuter vid 4 ° C.
  21. Ta bort etanol, puls snurra och ta bort rester av etanol.
  22. Tillsätt 500 l kall 70% etanol för att tvätta. Snurra på 13 000 g under 20 minuter vid 4 ° C.
  23. Ta bort 70% etanol, puls snurra och ta bort rester av etanol genom att pipettera.
  24. Lufttorka pellets med locket öppet i 10 minuter i rumstemperatur för att avlägsna alla spår av kvarvarande etanol.
  25. Resuspendera DNA i 50 ìl steriliseras dH2O över natten vid 4 ° C.
  26. Kvantifiera DNA med en NanoDrop spektrofotometer. En A 260: Ett 280 förhållandet 1,8 är idealiskt.
  27. Bestäm DNA-kvalitet och storlek utbud på en agarosgel med 100 bp stege. Så lite som 10 ng arvsmassans DNA kan köras på en 1,7% agarosgel följt av färgning hjälp av ett färgämne som är mycket känslig för små mängder DNA som SYBR Gold.
  28. I en silikoniserad tub per prov, förbereda ett mikrogram av DNA i en total volym på 50 l med resten av volymen består med sterilt dH 2 O.

DNA sonication

DNA sonication och MeDIP protokollet måste utföras siliconzied rören för att förhindra icke specifik bindning av proteiner till röret väggar. Optimal sonication tider för DNA-prov är baserade på graden av DNA-provet fragmentering som bestäms av gelelektrofores (steg 27). Till exempel bör DNA från odlade celler vara av mycket hög molekylvikt, och kommer därefter att kräva mer ultraljudsbehandling än DNA extraherat från arkiverade prover som ofta är delvis försämrad. Om proverna av enhetligt hög molekylvikt, är det rimligt i detta skede att fortsätta med sonication som beskrivs i detta protokoll utan att kontrollera varje prov för sig. Om proverna fragmenterade som med arkivens prover kommer det att bli nödvändigt att anpassa sonication förfarande sannolikt genom att minska ultraljudsbehandling gånger för att få 300-100 bp fragment. Om du räknar med att bearbeta prover som är delvis försämrad, optimering av ultraljudsbehandling parametrar kan utföras på ett representativt urval från de av intresse. Baserat på graden av DNA-fragmentering observerade från gelelektrofores (steg 27), kan försöksledaren förutbestämma den optimala sonication tid för provet. Här beskriver vi en metod för att få 300-1000 bp DNA-fragment av ultraljudsbehandling med ett automatiserat sonicating enhet (Bioruptor från Diagenode, UCD-200 TM) med hög molekylvikt DNA.

  1. Vatten i Biorupter måste vara vid 4 ° C.
  2. Sonikera 7 minuter på automatiska inställningar (30 sek på 30 sek av vid maximal effekt).
  3. Ta bort 800 ng (40 l) av sonicated produkt och plats i silikoniserad 1,7 ml centrifugrör för immunoprecipitation (IP) reaktion.
  4. Avsätt återstående 200 ng (10 l) för att fungera som ingång (IN) referens-DNA (förvaras vid 4 ° C).

    IMMUNOPRECIPITATON metylerade DNA

    1. Denaturera DNA som kommer att användas för IP reaktion (800 ng) vid 95 ° C i 10 minuter i ett vattenbad.
    2. Kyl omedelbart på is. Låt DNA svalna helt (ca 5 min på is) innan du fortsätter med nästa steg.
    3. Tillsätt 5 mikrogram monoklonal antikropp.
    4. Lägg till IP-buffert (används vid rumstemperatur under hela detta protokoll) till en slutlig volym på 500 l.
    5. Inkubera 2 timmar vid 4 ° C i roterande rör hållaren.
    6. Strax innan steg 5 är klar, förbereda Dynabeads genom tvättning (steg 6-11). Först resuspendera kulorna ordentligt i flaskan genom att vortexa.
    7. Överför 30 l (~ 2 x 10 7) återsuspenderad Dynabeads per reaktion plus 1, till en ny silikoniserad rör (till exempel om att göra 8 reaktioner, bort nog pärlor för 9, dvs 270 l).
    8. Placera röret på den magnetiska rack för 2 minuter i rumstemperatur.
    9. Pipettera av supernatanten. När du tar bort supernatanten, undvik att röra kulorna mot insidan (där pärlorna lockar till magneten) med pipettspetsen.
    10. Ta bort röret från magneten och resuspendera pärlor i ett överskott volym IP buffert (750 l-1000 l). Placera röret tillbaka på den magnetiska rack för 2 minuter i rumstemperatur.
    11. Upprepa tvätta en gång, och sedan resuspendera tvättas pärlor i IP-buffert i den ursprungliga volymen bort i steg 7.
    12. Tillsätt 30 l av tvättad Dynabeads till varje IP-reaktion
    13. Inkubera i en roterande slang hållare för 2 timmar vid 4 ° C.
    14. Efter inkubation är klar, placera röret på den magnetiska rack för 2 minuter i rumstemperatur.
    15. Pipettera av supernatanten. Undvik att röra vid insidan av röret (där pärlorna lockar till magneten) med pipettspetsen. Tillsätt 500 l av IP-buffert. Blanda röret innehållet och satte den tillbaka på den magnetiska rack för 2 min. Upprepa tvätta med 500 ul IP buffert en gång.
    16. Efter att vätskefasen från det sista tvättningen, resuspendera pärlor i 400 l av matsmältningen buffert.
    17. Behandla reaktion med 100 mikrogram av proteinas K och inkubera över natten vid 50 ° C.

    RENING AV IMMUNOPRECIPITATED DNA

    1. Tillsätt 500 l 01:01 fenol / kloroform pH 7 och skaka ordentligt.
    2. Snurra på 13 000 g under 10 minuter vid rumstemperatur.
    3. Ta bort vattenlösning (överst) fraktionen till ett nytt rör.
    4. Upprepa steg 1 till 3 om interfas mellan vattenfasen och den organiska lager grumlig.
    5. Tillsätt 1 / 10: e volym 3 M natriumacetat (40 l) och skaka.
    6. Tillsätt 1 l av glykogen (20 mikrogram / l) och skaka.
    7. Tillsätt 2 volymer (1000 l) på 100% etanol, virvel, och placera vid -20 ° C i 20 minuter.
    8. Snurra på 13 000 g under 20 minuter vid 4 ° C.
    9. Ta bort etanol, puls snurra och ta bort rester av etanol.
    10. Tillsätt 500 l kall 70% etanol för att tvätta. Vortex kort och snurra på 13 000 g under 20 minuter vid 4 ° C.
    11. Ta bort 70% etanol, puls snurra och ta bort rester av etanol genom att pipettera.
    12. Lufttorka pellets med locket öppet i 10 minuter i rumstemperatur för att avlägsna alla spår av kvarvarande etanol.
    13. Resuspendera DNA pelleten i 10 l steriliserade dH 2 0.

    Validering av PCR

    1. Du kan testa att säkerställa att din MeDIP förfarande fungerar genom att utföra MeDIP protokollet med vanliga människans DNA (man eller kvinna), och därefter testmetoder för en region känd för att vara berikad för metylering.
    2. Ta bort 30% av MeDIP produkt till PCR-röret, och ytterligare 30% av MeDIP produkt till en annan PCR-rör.
    3. Sätt 10 ng i DNA i en PCR-rör och 10 ng i DNA till ett annat PCR-rör. Du bör nu ha fyra separata PCR-reaktioner att ställa upp.
    4. Utför PCR med hjälp av H19 och CTRL grundfärger anges i tabell 1.
    5. Förbered två mastermixes (en för varje primer set) för PCR-reaktioner med 12,5 l totala volymen som beskrivs i tabell 2.
    6. Thermocycle PCR med hjälp av de villkor som anges i tabell 3.
    7. Kör 5 ìl av PCR-produkter på en 2% agarosgel för visualisering.
    8. De förväntade resultaten för framgångsrik MeDIP visas i tabell 4.

    Tabeller

    Tabell 1: H19 och CTRL primers för PCR validering.

    Primer Set Framåt Primer Omvänd Primer Förväntad Produkt Storlek
    H19 H19_F 5'-cgagtgtgcgtgagtgtgag H19_R 5'-ggcgtaatggaatgcttgaa 174 bp
    CTRL (kontroll) CTRL_F5'-gagagcattagggcagacaaa CTRL_R 5'-gttcctcagacagccacattt 139 bp

    Tabell 2. Mastermixes för PCR reaktioner.

    2 O
    H19 Mix (per Rxn) CTRL Mix (per Rxn)
    6,875 6,875
    10X Buffer 1,25 1,25
    dNTP mix (10 mm vardera) 0,25 0,25
    MgCl 2 (50 mm) 0,25 0,25
    Primers (H19_F / R eller CTRL_F / R) (10 mikroM varje F / R) 0,625 0,625
    Platinum Taq 0,25 0,25

    Tabell 3. PCR thermocyling förhållanden.

    95 ° C 05:00
    40X
    95 ° C 00:30
    56 ° C 00:30
    72 ° C 00:15

    Tabell 4. Förväntade PCR-resultat för framgångsrik MeDIP.

    Mall DNA
    Primer I IP
    H19 Positiv Positiv
    CTRL Positiv Negativ

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns en växande medvetenhet om de betydande metylering roll DNA spelar i sjukdomen, är därför att utveckla testmetoder för att mäta denna modifiering blir allt viktigare 3, 12, 13. Den MeDIP tekniken är en mottaglig verktyg för screening på både hel-genomet och locus-specifik nivå 6, 7. Denna teknik ger en snabb bild av nivåer DNA-metylering med hjälp av begränsade mängder start DNA och gör det lätt att jämförelser mellan olika källor. Nedströms program som använder MeDIP produkten innehåller en mängd olika microarrays som hela genomet och CpG ö arrayer oligonukleotid, direkt PCR-analyser för loci av intresse, liksom sekvensering.

MeDIP ger en tydlig metod för DNA-metylering upptäckt som är beroende av antikroppar för att skilja metylerade och unmethylated DNA-6. Medan MeDIP är snabbare än traditionell bisulfite sekvensering metoder och det är inte begränsat till analys av specifika sekvenser som restiktionsenzymanalys kommer immunoprecipitation vara beroende av DNA-sekvens, inklusive CpG densitet, repetitiva inslag närvaro och sammansättning. Således lämpliga kontroller, som med alla experiment, är viktiga för analys och tolkning av MeDIP resultat.

Det finns flera steg i hela MeDIP teknik där extra försiktighet måste iakttas. Dessa inkluderar: användning av silikoniserade rör för att förhindra att icke-specifik bindning av DNA till röret väggar, säkerställa tillräckliga fragmentering av DNA efter ultraljudsbehandling, och se till att DNA är fullständigt denaturerad. Dessutom, notera att kvantifiering av enkelsträngat MeDIP produkt kan vara svårt eftersom det finns en begränsad mängd material och många vanliga tekniker för att uppskatta DNA-mängd, såsom spektrofotometri, fungerar bäst med dubbelsträngat DNA. Dessutom är det viktigt att uppmärksamma rätt laborationer säkerheten vid alla tillfällen, speciellt när frätande ämnen såsom fenol används.

Den MeDIP Tekniken kan också ändras på flera steg. Viktigt protokollet kan skalas upp eller ner för att möjliggöra ökad avkastning, eller arbeta med begränsat urval. En alternativ fragmentering tillvägagångssätt, såsom användning av begränsning enzymer (t.ex. Alu jag matsmältningen), minskar krav på utrustningen, men kan också införa fördomar potentiellt begränsar DNA dra ner i vissa regioner. Som med alla synsätt, är resultaten bäst valideras med hjälp av en alternativ metod för DNA-metylering upptäckt 1, 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi vill tacka medlemmarna i Brown och Lam labb för deras deltagande i kritisera denna video och artikel. Detta arbete stöddes av medel från den kanadensiska Institutes for Health Research och Michael Smith Stiftelsen för hälsoforskning.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Biorupter sonicator Tool Diagenode UCD-200 TM
1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes Other Sorenson BioScience 11510
ND 3300 Spectrophotometer Tool NanoDrop
Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb Reagent Calbiochem 162 33 D3
Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG Reagent Invitrogen 112-01D
Magnetic Tube Rack Tool Invitrogen CS15000
Mini LabRoller Tool Labnet International H5500
IP Buffer 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature
Digestion Buffer 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
  2. Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
  3. Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
  4. Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
  5. Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
  6. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
  7. Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
  8. Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
  9. Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
  10. Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
  11. Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
  12. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
  13. Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
  14. Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).

Comments

7 Comments

  1. The instrument you are using is a NanoDrop 1000 Spectrophotometer, not a NanoDrop 3300 Fluorospectrometer.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 26, 2009 - 3:40 PM
  2. Dear Madams and Sirs, in the protocol you say that you sonicate 1 µg of genomic DNA and that you therefrom use 800 ng for MeDIP but I can' t find an information about the enrichment in percent.
    I would be obliged if you could give me this information because I want to try MeDIP with low amounts of DNA and so I' m very interested in your protocol. Thank very much for your efforts!!! best regards
    Sabrina Pichler

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 6, 2009 - 10:11 AM
  3. Hi Sabrina,
    We do not quantitate the enrichment of methylated DNA recovered after MeDIP in terms of a percentage. We just check for the presence of known methylated sequences and the absence of non-methylated sequences in our MeDIP product. It is possible to roughly estimate MeDIP yield using agarose gel electrophoresis and a DNA stain that will visualize single stranded DNA, such as SYBR Gold.

    Thank you for your interest.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 2:41 PM
  4. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Lyudmyla S.
    October 5, 2009 - 10:10 AM
  5. We noticed that DNA directly bound to magnetic bead_protein A even without 5 mc Ab and could be eluted by simply heating. I wonder if you have this problem in your experiment. Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 17, 2010 - 5:31 PM
  6. Hello!
    I am trying watch the video on meDIP experiment but only sound is available from the title as DNA preparation and immunoprecipitation. Would you please let me know how I can watch the video perfectly?

    Thank you in advance for your cooperation.

    Best regards,
    Raj Bose

    Reply
    Posted by: Raj B.
    May 19, 2011 - 7:07 AM
  7. Hi Raj,

    For trouble viewing the video, the JoVE troubleshooting link says to install/uninstall Flash.

    http://www.jove.com/Page.php?name=Troubleshooting

    If that dŒsn't work, contact support@jove.com and they should be able to help you.

    Good luck!

    Emily

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 24, 2011 - 2:07 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics