Создание Patch-пипетки и Sharp Электроды с программируемой Puller

Published 10/08/2008
6 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Это видео показывает, как использовать программируемые съемник, чтобы сделать патч пипетки и острые электроды для электрофизиологии. Аналогичная процедура может быть использована для разнообразных стеклянных инструментов, в том числе введение иглы.

Cite this Article

Copy Citation

L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Стекло микроэлектродов (также называется пипетки) были лошадкой электрофизиологии на протяжении десятилетий. Сегодня такие пипетки изготавливаются из стеклянных капилляров использованием программируемых съемника. Такое тепло инструментов капиллярной используя либо нити металла или лазера и извлечь из стекла, используя гравитацию, двигателя или обоих. Пипетки для патч-зажим записи формируются с использованием только тепло и гравитация, в то время как резкое электродов для внутриклеточной регистрации использовать сочетание тепла, тяжести, и двигатель. Процедура используется для внутриклеточных пипетки записи аналогична используется, чтобы сделать инъекции иглами для различных приложений, в том числе кРНК инъекции в ооциты Xenopus. В общем, капиллярные стеклянные <1,2 мм в диаметре используется для изготовления пипеток для исправления записи зажим, в то время как узкие стекло используется для внутриклеточной регистрации (наружный диаметр = 1,0 мм). Для каждого инструмента, съемник запрограммировано несколько иначе. Это видео показывает, как сделать оба вида записи пипетки с использованием предварительно установленными программами съемника.

Protocol

Тяговая пипетки

Использование микроэлектрода съемник, таких как Саттер Р-97 Flaming / Браун, тянуть набор примерно 10-20 пипеток.

  1. Выберите капиллярной стекла. Мы используем боросиликатного капилляров (Саттер BF150-110-10, внешний диаметр 1,5 мм, 1,1 мм внутренний диаметр, 10 см в длину). Магазин стекла осторожно, чтобы она остается чистой и без пыли.
  2. Дизайн потянув программы. Мы используем 5-ти ступенчатая программа, с нисходящим тепла и скорость на каждом этапе, и небольшой тянуть на последний шаг. Пипетки поваренную книгу Саттера является отличным основу для разработки соответствующих программ.
  3. Проверьте наконечники под микроскопом, чтобы определить диаметр открытия и гладкость. Отменить грубая, неровная, или нерегулярные советы. Хороший потянув протокол должен обеспечить эти редки. Для стандартных патч-зажим записи, наконечник отверстия должны быть 1-3 мкм в диаметре. Крутым конусом (тупым кончиком) приводит к снижению сопротивления для того же диаметра отверстия. Форма и размеры могут быть изменены под давлением полировки.

Пипетки пожарной полировки

  1. Настройка полировки машина (microforge) с платиновая нить отопления управляется ножной педалью. Полезный комплект можно получить в Научно ALA (CPM-2) или аналогичные устройства могут быть собраны по частям.
  2. Дополнительно: Пальто пипетки с изолятором для уменьшения емкости и улучшения шумовых характеристик. Мы используем зубных слепков. Sylgard 184 ™ (поли-диметил силоксановых эластомеров также известный как PDMS) тоже вариант.
  3. При использовании воска, сохранить небольшой расплавленный питания поблизости. При давлении воздуха на задней пипетки сохранить воск от входа в пипетку, окуните кончик кратко в жидкий воск и удалить. С Sylgard, хранения подготовленных эластомера в замороженных аликвоты и краски пипетки под микроскопом. Тепло вылечить эластомера.
  4. Место пипетки (с покрытием или нет) в полировке аппарата и довести кончике ~ 50 микрон от нити. Имейте в виду, что нить будет расширяться при нагревании.
  5. Рекомендуем: Следуйте отдельный протокол для "давления полировки", чтобы изменить форму пипетки для оптимального сопротивления и диаметр кончика.
  6. Короткого импульса тепла (1-2 секунды) является достаточным для удаления воска от кончика пипетки и гладким стеклом.
  7. Место готовой пипетки в фургон для защиты от пыли, повторите для 10 успешных пипеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол показано здесь в ежедневном использовании в электрофизиологии лабораторий, а также используется, чтобы сделать инъекции иглами для клеток и животных. С программируемой съемник, это легко сделать пипетки для различных целей. С вниманием и заботой, нити на съемник будет длиться в течение одного года или более. Удачи вам в ваших экспериментах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Мы благодарим следующие финансовые учреждения и фонды поддержки: Национальный институт здоровья, Национальный научный фонд, Американской кардиологической ассоциации, Ассоциации мышечной дистрофии, Дональд Б. и Делия Э. Бакстер Фонда Klingenstein фонд и фонд поддержки McKnight Neuroscience.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats