एक निर्देशयोग्य खींचने के साथ पैच pipettes और तीव्र इलेक्ट्रोड बनाना

Published 10/08/2008
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Biology

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Summary

इस वीडियो से पता चलता है कि कैसे एक प्रोग्राम खींचने का उपयोग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए पैच pipettes और तेज इलेक्ट्रोड बनाने. उसी प्रक्रिया के लिए इंजेक्शन सुई सहित काँच उपकरण की एक किस्म बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है है.

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L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

ग्लास microelectrodes (pipettes भी कहा जाता है) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के दशकों के लिए एक workhorse किया गया है. आज, ऐसे pipettes गिलास capillaries से बना रहे हैं एक प्रोग्राम खींचने का उपयोग कर. इस तरह के उपकरणों या तो एक धातु फिलामेंट या एक लेजर और बाहर गुरुत्वाकर्षण, एक मोटर या दोनों का उपयोग करते हुए कांच आकर्षित का उपयोग केशिका गर्मी. पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए pipettes केवल गर्मी और गुरुत्व का उपयोग का गठन कर रहे हैं, जबकि intracellular रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोड तेज गर्मी, गुरुत्वाकर्षण, और एक मोटर का एक संयोजन का उपयोग करें. intracellular रिकॉर्डिंग pipettes बनाने के लिए इस्तेमाल की प्रक्रिया के लिए आवेदनों की एक किस्म के लिए इंजेक्शन सुई Xenopus oocytes में क्रेना इंजेक्शन सहित, बनाने के लिए इस्तेमाल करने के लिए इसी तरह की है. सामान्य, केशिका गिलास में <व्यास में 1.2 मिमी पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए pipettes करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि संकरा कांच intracellular रिकॉर्डिंग (बाहरी व्यास = 1.0 मिमी) के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रत्येक उपकरण के लिए, खींचने थोड़ा अलग क्रमादेशित है. इस वीडियो से पता चलता है कि रिकॉर्डिंग pipettes पूर्व स्थापित खींचने प्रोग्राम का उपयोग कर के दोनों प्रकार बनाने के लिए.

Protocol

पुलिंग pipettes

P-97 ज्वलंत / ब्राउन Sutter के रूप में खींचने जैसे microelectrode का उपयोग, लगभग 10-20 pipettes का एक सेट खींचो.

  1. अपने केशिका गिलास का चयन करें. हम borosilicate capillaries (BF150-110-10 Sutter, 1.5mm बाहरी व्यास, 1.1mm भीतरी व्यास, लंबे 10cm) का उपयोग करें. कांच स्टोर सावधानी से तो यह साफ है और धूल मुक्त रहता है.
  2. एक खींच प्रोग्राम डिजाइन. हम उतरते गर्मी और हर कदम पर वेग, और अंतिम चरण पर एक छोटे पुल के साथ एक 5 कदम प्रोग्राम का उपयोग करें. Sutter विंदुक रसोई की किताब उपयुक्त कार्यक्रम के विकास के लिए एक उत्कृष्ट संदर्भ है.
  3. जांच करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे खोलने के व्यास और चिकनाई निर्धारित विंदुक युक्तियाँ. किसी न किसी तरह, असमान या अनियमित सुझावों त्यागें. एक अच्छा प्रोटोकॉल खींच यह सुनिश्चित करना चाहिए कि इन दुर्लभ हैं. मानक पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए, टिप उद्घाटन व्यास में 1-3 microns होना चाहिए. एक खड़ी शंकु (कुंद टिप) ही खोलने व्यास के लिए प्रतिरोध कम होता है. आकृति और आकार दबाव चमकाने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है.

फायर चमकाने pipettes

  1. एक प्लैटिनम हीटिंग एक पैर पेडल द्वारा नियंत्रित फिलामेंट के साथ चमकाने रिग (microforge) सेट. ALA (सीपीएम -2) वैज्ञानिक या एक समान तंत्र टुकड़ों में इकट्ठा किया जा सकता से एक उपयोगी किट उपलब्ध है.
  2. वैकल्पिक: एक समाई कम होती है और शोर विशेषताओं में सुधार विसंवाहक कोट के साथ विंदुक . हम दंत मोम का उपयोग करें. 184 ™ Sylgard (पाली - डाइमिथाइल siloxane भी PDMS के रूप में जाना जाता इलास्टोमेर) भी एक विकल्प है.
  3. मोम का उपयोग कर अगर, एक छोटे से पिघला हुआ आपूर्ति पास रहते हैं. विंदुक विंदुक में प्रवेश करने से मोम रखने के पीठ पर हवा के दबाव के साथ, तरल मोम में टिप संक्षिप्त डुबकी और निकालना. Sylgard के साथ, दुकान जमी aliquots में तैयार elastomer और एक खुर्दबीन के नीचे विंदुक टिप रंग. Elastomer इलाज हीट.
  4. चमकाने तंत्र में पिपेट लेपित (या नहीं) प्लेस और टिप लाने ~ फिलामेंट से 50 microns. ध्यान रखें कि फिलामेंट जब गरम का विस्तार होगा.
  5. अनुशंसित: इष्टतम प्रतिरोध और टिप व्यास के लिए विंदुक के आकार को बदलने के लिए "दबाव चमकाने" के लिए अलग अलग प्रोटोकॉल का पालन करें.
  6. एक संक्षिप्त गर्मी नाड़ी (1-2 सेकंड) पिपेट की नोक से मोम हटाने और गिलास चिकनी के लिए पर्याप्त है.
  7. एक बंद को धूल से बचाने के लिए, 10 सफल pipettes के लिए दोहराएँ बॉक्स में समाप्त विंदुक रखें.

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Discussion

प्रोटोकॉल सचित्र यहाँ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगशालाओं में दैनिक उपयोग में है और यह भी कोशिकाओं और जानवरों के लिए इंजेक्शन सुई बनाने के लिए इस्तेमाल किया. एक प्रोग्राम खींचने के साथ, यह आसान है का उपयोग करता है की एक किस्म के लिए pipettes बनाने है. ध्यान और देखभाल के साथ, अपने खींचने पर फिलामेंट एक साल या उससे अधिक के लिए पिछले जाएगा. अपने प्रयोगों के साथ गुड लक.

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Acknowledgements

स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन, पेशी Dystrophy एसोसिएशन, डोनाल्ड बी और डेलिया ई. बैक्सटर फाउंडेशन, Klingenstein फंड और तंत्रिका विज्ञान के लिए McKnight बंदोबस्ती: हम निम्नलिखित वित्तपोषी एजेंसियों और नींव समर्थन के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

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