프로그래밍 풀러와 패치 - pipettes와 샤프 전극을 만들기

Published 10/08/2008
6 Comments
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Biology

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Summary

이 동영상은 전기 생리학에 대한 패치 pipettes과 날카로운 전극을 만들 수있는 프로그램 풀러를 사용하는 방법을 보여줍니다. 동일한 절차는 주사 바늘을 포함한 유리 다양한 도구를 만드는 데 사용할 수 있습니다.

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L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

유리 microelectrodes는 (또한 pipettes라고도 함) 수십 년 동안 전기 생리학의 일하는 말이되어 왔습니다. 오늘날과 같은 pipettes은 프로그램 풀러를 사용하여 유리 모세관에서 만들어집니다. 이러한 악기 열 금속 필라멘트 또는 레이저와 중력, 모터 또는 둘 모두를 사용하여 유리를 그릴 중 하나를 사용하여 모세관. 세포내 레코딩을위한 날카로운 전극은 열, 중력, 그리고 모터의 조합을 사용하는 동안 패치 - 클램프 녹음 Pipettes은 단 열과 중력을 이용하여 형성됩니다. 세포내 기록 pipettes를 만들기 위해 사용되는 절차는 Xenopus의 oocytes에 cRNA 분사를 포함한 다양한 어플 리케이션을위한 주사 바늘을 만들기 위해 사용하는 것과 비슷합니다. 좁은 유리 세포 기록 (외경 = 1.0 ㎜)에 사용되는 동안 일반적으로, 모세관 유리에 직경 <1.2 mm은 패치 클램프 녹음 pipettes을하는 데 사용됩니다. 각 도구에 대한, 풀러가 약간 다르게 프로그램입니다. 이 비디오는 사전에 설립 풀러 프로그램을 사용 기록 pipettes 두 가지를하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

풀링 pipettes

풀러 등 서터 P - 97 플라밍 / 브라운으로 microelectrode를 사용하여 약 10-20 pipettes 세트를 가져옵니다.

  1. 당신의 모세관 유리를 선택합니다. 우리는 borosilicate 모세관 (서터 BF150 - 110 - 10, 1.5mm 외경, 내경 1.1mm, 길이 10cm)을 사용합니다. 그것이 깨끗하고 먼지가 무료로 남아 있도록 신중하게 유리를 저장합니다.
  2. 당기는 프로그램을 디자인합니다. 우리는 내림차순 열과 속도의 각 단계에서, 그리고 마지막 단계에있는 작은 당겨와 5 단계 프로그램을 사용합니다. 서터의 피펫 요리책은 적합한 프로그램을 개발하기위한 훌륭한 레퍼런스입니다.
  3. 개방 직경과 매끄러운를 결정하는 현미경 피펫 팁을 검사합니다. 거친 고르지 또는 불규칙 조언을​​ 폐기하십시오. 좋은 당기는 프로토콜이가 드문 있도록해야합니다. 표준 패치 - 클램프 녹음, 팁 구멍은 직경 1-3 미크론해야합니다. 가파른 테이퍼 (뭉툭한 끝)은 같은 오프닝 직경에 대한 저항을 낮은 발생합니다. 모양과 크기가 압력 연마에 의해 수정할 수 있습니다.

소방 연마 pipettes

  1. 발 페달에 의해 통제 플래티넘 가열 필라멘트와 연마 장비 (microforge)를 설정합니다. 유용한 키트 에이러 과학 (CPM - 2) 또는 이와 유사한기구가 조금씩 조립하실 수 있습니다.
  2. 옵션 : 코트 용량을 감소 및 소음 특성을 개선하기 위해 절연체로 피펫. 우리는 치과 왁스를 사용합니다. Sylgard 184 ™은 (또한 PDMS로 알려진 폴리 디메틸 실록산 - 엘라스토머)도 옵션입니다.
  3. 왁스를 사용하는 경우, 작은 용융 공급이 근처에 보관. 피펫을 입력에서 왁스를 유지하기 위해 피펫의 뒷면에 공기 압력으로 액체 왁스에 팁 잠시을 찍어 제거합니다. Sylgard으로 저장, 준비 냉동 aliquots의 탄성과 현미경 피펫 팁을 페인트. 탄성체를 치료하기 위해 열.
  4. 연마 장치에 피펫을 (코팅 여부) 장소 및 팁에게 필라멘트에서 ~ 50 미크론 가져. 가열하면 필라멘트가 확장됩니다 유의하십시오.
  5. 추천 : 최적의 저항과 팁 직경에 대한 피펫의 모양을 변경하려면 "압력 연마"에 대한 별도의 프로토콜을 수행합니다.
  6. 간단한 열 펄스 (1~2초)는 피펫의 팁을에서 왁스를 제거하고 유리를 부드럽게하기 위해 충분하다.
  7. , 먼지로부터 보호하기 10 성공 pipettes을 반복하는 닫힌 상​​자에 완성된 피펫를 놓습니다.

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Discussion

프로토콜 그림 여기에 전기 생리학 실험실에서 일상 사용되고 또한 세포 및 동물 주입 바늘을하는 데 사용됩니다. 프로그램 풀러와 함께, 그것은 사용의 다양한 pipettes를 만들기 위해 쉽습니다. 관심과 관리를 통해 귀하의 풀러의 필라멘트는 1 년 이상 지속됩니다. 실험과 함께 행운을 빕니다.

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Acknowledgements

보건 국립 연구소, 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 미국 심장 협회, 근육질 영양 장애 협회, 도널드 B.와 델리아 E. 백스터 재단 Klingenstein 기금과 신경 과학에 대한 맥나이트 엔다우먼트 : 우리는 지원을위한 다음과 같은 자금 지원 기관 및 재단 감사드립니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

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