パッチピペットおよびプログラマブルプラーとシャープ電極作成

Published 10/08/2008
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Biology

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Summary

このビデオでは、パッチピペットと電気生理学のためのシャープな電極を作るためにプログラム可能なプーラーを使用する方法を示します。同じ手順は、注射針を含む​​ガラスの様々なツールを、作るために使用することができます。

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L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ガラス微小電極は、(また、ピペットと呼ばれる)数十年の電気生理学の主力となっている。今日は、そのようなピペットは、プログラム可能なプーラーを用いてガラスキャピラリーから作られています。このような楽器の熱金属のフィラメントまたはレーザーと重力、モーターまたは両方を使用してガラスを引き出すのいずれかを使用してキャピラリー。細胞内記録のための鋭い電極は、熱、重力、そしてモーターを組み合わせて使用​​しながらのパッチクランプ記録用ピペットは、唯一の熱と重力を用いて形成される。細胞内記録ピペットを作るために使用される手順は、アフリカツメガエルの卵母細胞へのcRNAを注入などの様々なアプリケーションのための注射針を、作るために使用されているものと似ています。狭いガラスは細胞内記録(外径= 1.0 mm)のために使用されるが、一般的に、直径のガラスキャピラリー<1.2 mmの、パッチクランプ記録用ピペットを行うために使用されます。各ツールの場合、プーラーは若干異なってプログラムされています。このビデオでは、事前に確立されたプーラーのプログラムを使用して記録ピペットの両方の種類を作成する方法を示します。

Protocol

引っ張っピペット

プラーなどサターP - 97火焔/ブラウンなどの微小電極を用いて、約10〜20ピペットのセットを引き出します。

  1. あなたのガラスキャピラリーを選択してください。我々は、ホウケイ酸毛細血管(サターBF150 - 110 - 10、長い1.5ミリメートル外径さ1.1mm内径、10センチメートル)を使用します。それは自由な汚れやほこりを保つように慎重にガラスを保管​​してください。
  2. 引っ張ってプログラムを設計します。我々は、各ステップで熱と速度を降順で、5段階のプログラムを使用し、そして最後のステップで小さなプル。サターのピペットの料理の本は、適切なプログラムを開発するための優れたリファレンスです。
  3. 開口径と滑らかさを決定するために顕微鏡下でピペットチップを調べます。荒い、でこぼこ、または不規則なヒントを捨てる。良い引きプロトコルは、これらはまれであることを確認する必要があります。標準のパッチクランプ記録のために、先端の開口部は直径の1-3ミクロンにする必要があります。急なテーパー(鈍端)が同じ開口径のために抵抗を下げるために導く。形状と大きさは圧力の研磨によって変更することができます。

火災の研磨ピペット

  1. フットペダルで制御されるプラチナの加熱フィラメントと研磨リグ(マイクロフォージ)を設定します。有用なキットは、ALAサイエンティフィック(CPM - 2)または類似の装置から入手可能です少しずつ組み立てることができます。
  2. オプション:コート静電容量を減少させるとノイズ特性を向上させるために絶縁体とのピペット。我々は、歯科用ワックスを使用しています。 Sylgard 184™は、(また、PDMSと呼ばれるポリジメチルシロキサンエラストマー)もオプションです。
  3. ワックスを使用する場合、近くの小さな溶融供給を維持する。ピペットを入力してからワックスを保つためにピペットの背面の空気の圧力で、液体のワックスに簡単に先端を浸して削除する。 Sylgardと、店舗準備冷凍アリコートのエラストマーと顕微鏡下でピペットの先端をペイント。エラストマーを治すために加熱する。
  4. 研磨装置にピペットを(コーティングされたかどうか)に置き、先端〜フィラメントから50ミクロンをもたらす。加熱するとフィラメントが拡大することに留意してください。
  5. 推奨 :最適な抵抗と先端径のためのピペットの形状を変更するには"圧力研磨"のための別のプロトコルに従ってください。
  6. 短い熱パルス(1〜2秒)は、ピペットの先端からワックスを除去し、ガラスを滑らかにするだけで十分です。
  7. ほこりから守るために密閉ボックス10の成功ピペットの繰り返しで完成したピペットを置きます。

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Discussion

ここでプロトコル図示の電気生理学実験室での日常使用されており、細胞および動物用注射針を作るためにも使用されます。プログラム可能な引き手で、それには、さまざまな用途のためにピペットを作るのは簡単です。注意と慎重に、あなたのプーラーでフィラメントは、一年以上持続します。あなたの実験の成功をお祈りします。

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Acknowledgements

国立衛生研究所、国立科学財団、米国心臓協会、筋ジストロフィー協会、ドナルドB.とデリアE.バクスター財団、Klingenstein基金と神経科学のためのマックナイト基金:我々は、サポートについては、次の資金提供機関や財団に感謝します。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

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