Göra Patch-pipetter och Sharp Elektroder med en programmerbar Puller

Published 10/08/2008
6 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Denna video visar hur man använder en programmerbar avdragare för att göra patch pipetter och skarpa elektroder för elektrofysiologi. Samma förfarande kan användas för att göra en mängd olika glas verktyg, inklusive injektionsnålar.

Cite this Article

Copy Citation

L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Glas microelectrodes (även kallad pipetter) har en arbetshäst elektrofysiologi i årtionden. Idag är en sådan pipetter av glas kapillärerna med hjälp av en programmerbar avdragare. Sådana instrument värma kapillär med hjälp av antingen en metall glödlampor eller en laser och dra ut glaset med allvar, en motor eller både och. Pipetter för patch-clamp inspelning bildas med enbart värme och allvar, medan vassa elektroder för intracellulär inspelning använder en kombination av värme, allvar och en motor. Förfarandet används för att göra intracellulära inspelning pipetter liknar den som används för att göra injektionsnålar för en mängd olika tillämpningar, inklusive Crna injektion i Xenopus oocyter. I allmänhet kapillär glas <1,2 mm i diameter används för att göra pipetter för patch clamp inspelning, medan smalare glas används för intracellulär inspelning (ytterdiameter = 1,0 mm). För varje verktyg är avdragare programmerat något annorlunda. Denna video visar hur man kan göra båda typer av inspelning pipetter med hjälp av på förhand fastställda avdragare program.

Protocol

Dra pipetter

Med hjälp av en mikroelektrod avdragare som Sutter P-97 Flaming / Brown, dra en uppsättning av ca 10-20 pipetter.

  1. Välj din kapillär glas. Vi använder borosilikat kapillärer (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm ytterdiameter, 1,1 mm innerdiameter, 10cm lång). Förvara glaset försiktigt så att det förblir rent och dammfritt.
  2. Designa en dra-program. Vi använder en 5 stegs program, med fallande värme och hastighet för varje steg, och en liten dra på det sista steget. Sutter har pipett kokbok är en utmärkt referens för att utveckla lämpliga program.
  3. Undersök pipettspetsar under ett mikroskop för att fastställa öppna diameter och jämnhet. Kasta grov, ojämn, eller oregelbundna tips. En bra att dra protokoll bör säkerställa att dessa är sällsynta. För standard patch-clamp inspelning ska spets öppningar vara 1-3 mikrometer i diameter. En brant kona (trubbig spets) leder till lägre motstånd för samma öppning diameter. Form och storlek kan ändras av trycket polering.

Brand polering pipetter

  1. Inrätta en polering rigg (microforge) med en platina uppvärmning glödtråd styrs av en fotpedal. En användbar kit finns från ALA Scientific (CPM-2) eller en liknande apparat kan monteras bit för bit.
  2. Tillval: Coat pipetten med en isolator för att minska kapacitansen och förbättra buller egenskaper. Vi använder dentala vax. Sylgard 184 ™ (poly-dimetyl siloxan elastomer även känd som PDMS) är också ett alternativ.
  3. Om du använder vax, hålla ett litet smält utbud i närheten. Med lufttryck på baksidan av pipetten för att hålla vax från att komma in pipetten, doppa spetsen kort i flytande vax och ta bort. Med Sylgard, lagra beredd elastomer i frysta alikvoter och måla pipettspetsen under ett mikroskop. Värm att bota elastomer.
  4. Placera pipetten (bestruket eller inte) i polering apparaten och sätta spetsen ~ 50 mikrometer från glödtråden. Tänk på att glödlampan kommer att expandera vid uppvärmning.
  5. Rekommenderas: Följ separat protokoll för "trycket polering" för att ändra formen på pipetten för optimal motståndskraft och dricks diameter.
  6. En kort uppvärmning puls (1-2 sekunder) är tillräcklig för att ta bort vax från spetsen av pipetten och jämna glaset.
  7. Placera den färdiga pipetten i en sluten låda för att skydda från damm, upprepa för 10 framgångsrika pipetter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet bilden är här i dagligt bruk i elektrofysiologi laboratorier och används också för att göra injektionsnålar för celler och djur. Med en programmerbar avdragare är det lätt att göra pipetter för olika användningsområden. Med uppmärksamhet och omsorg, kommer glödtråden på din avdragare pågå i ett år eller längre. Lycka till med dina experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi tackar följande finansiärer och stiftelser till stöd: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, muskeldystrofi Association, Donald B. och Delia E. Baxter Foundation, Klingenstein fonden och McKnight Endowment for Neuroscience.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats