Hacer patch pipetas y electrodos de Sharp con un extractor programable

Published 10/08/2008
6 Comments
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Biology

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Summary

Este vídeo muestra cómo usar un extractor de programación para pipetas de parches y electrodos para electrofisiología fuerte. El mismo procedimiento puede ser utilizado para hacer una variedad de herramientas de vidrio, incluyendo agujas de inyección.

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L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

Microelectrodos de vidrio (también llamado pipetas) han sido un caballo de batalla de la electrofisiología durante décadas. Hoy en día, las pipetas son hechas de capilares de vidrio con un extractor programables. El calor de esos instrumentos el capilar utilizando un filamento de metal o un láser y sacar el cristal con la gravedad, un motor o ambos. Pipetas para la grabación de patch-clamp se forman con el calor y sólo la gravedad, mientras que los electrodos de registro intracelular fuerte uso de una combinación de calor, la gravedad, y un motor. El procedimiento utilizado para pipetas intracelular de grabación es similar a la utilizada para fabricar agujas de inyección para una variedad de aplicaciones, incluyendo la inyección de cRNA en ovocitos de Xenopus. En vidrio en general, capilar <1,2 mm de diámetro se utiliza para hacer las pipetas para la grabación de patch clamp, mientras más estrecho de vidrio se utiliza para el registro intracelular (diámetro externo = 1,0 mm). Para cada herramienta, el tirador está programado de forma ligeramente diferente. Este video muestra cómo hacer que los dos tipos de pipetas de grabación mediante programas preestablecidos extractor.

Protocol

Pipetas tirando

El uso de un extractor de microelectrodos como el Sutter P-97 Flaming / Brown, tirar de un conjunto de aproximadamente 10 a 20 pipetas.

  1. Seleccione su vaso capilar. Usamos borosilicato capilares (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm de diámetro exterior, diámetro interior 1,1 mm, 10 cm de largo). Almacenar el vidrio con cuidado para que permanezca limpia y libre de polvo.
  2. Diseñar un programa de extracción. Nosotros usamos un programa de cinco pasos, con el calor y la velocidad desciende a cada paso, y un sofá pequeño en el paso final. Libro de cocina de Sutter pipeta es una excelente referencia para el desarrollo de programas adecuados.
  3. Examine la punta de la pipeta con un microscopio para determinar el diámetro de apertura y suavidad. Deseche las puntas ásperas, desiguales o irregulares. Un buen protocolo tirando debe garantizar que estos son poco frecuentes. Para el estándar de grabación de patch-clamp, las aberturas de punta debe ser 1.3 micrones de diámetro. Un cono empinado (punta roma) conduce a una menor resistencia para el diámetro de apertura. Forma y tamaño pueden ser modificados por la presión de pulido.

Pipetas de fuego pulido

  1. Establecer una plataforma de pulir (microforge) con un filamento de platino de calefacción controlado por un pedal. Un kit de útiles está disponible a partir de ALA Científicas (CPM-2) o un aparato similar se puede montar poco a poco.
  2. Opcional: Escudo de la pipeta con un aislante para reducir la capacidad y mejorar las características de ruido. Nosotros usamos la cera dental. Sylgard 184 ™ (poli-dimetil elastómero de siloxano también conocido como PDMS) es también una opción.
  3. Si se utiliza la cera, mantener un suministro de líquido pequeños cerca. Con la presión del aire en la parte posterior de la pipeta para mantener la cera de entrar en la pipeta, moje la punta brevemente en la cera líquida y remover. Con Sylgard, elastómero tienda preparado en alícuotas congeladas y pintar la punta de la pipeta con un microscopio. Calor para curar el elastómero.
  4. Coloque la pipeta (recubiertos o no) en el aparato de pulir y llevar la punta ~ 50 micrones del filamento. Tenga en cuenta que el filamento se expande cuando se calienta.
  5. Recomendado: Siga el protocolo para "pulir la presión" para cambiar la forma de la pipeta para una óptima resistencia y diámetro de la punta.
  6. Un pulso de calor breve (1-2 segundos) es suficiente para quitar la cera de la punta de la pipeta y el vidrio suave.
  7. Coloque la pipeta terminó en una caja cerrada para proteger del polvo, de repetición para 10 pipetas de éxito.

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Discussion

El protocolo se ilustra aquí es de uso diario en los laboratorios de electrofisiología, y también se utiliza para fabricar agujas de inyección de células y animales. Con un extractor de programación, es fácil de hacer pipetas para una variedad de usos. Con atención y cuidado, el filamento en su extractor tendrá una duración de un año o más. Buena suerte con sus experimentos.

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Acknowledgements

Agradecemos a los siguientes organismos de financiación y fundaciones de apoyo: National Institutes of Health, National Science Foundation, la American Heart Association, Asociación de Distrofia Muscular, de la B. Donald y Delia E. Baxter Foundation, el Fondo Klingenstein y la Fundación McKnight para la Neurociencia.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

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