Het maken van Patch-pipetten en Sharp elektroden met een programmeerbare Puller

Published 10/08/2008
6 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Deze video laat zien hoe u een programmeerbare trekker te gebruiken om patch pipetten en scherpe elektroden te maken voor elektrofysiologie. Dezelfde procedure kan gebruikt worden om een ​​verscheidenheid van glazen instrumenten, waaronder injectienaalden te maken.

Cite this Article

Copy Citation

L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Glazen micro-elektroden (ook wel pipetten) zijn een werkpaard van elektrofysiologie voor decennia. Vandaag de dag worden dergelijke pipetten gemaakt van glas haarvaten met behulp van een programmeerbare trekker. Dergelijke instrumenten warmte van de capillaire met behulp van een metalen filament of een laser en trekken uit het glas met behulp van de zwaartekracht, een motor of beide. Pipetten voor patch-clamp opnamen worden gevormd met alleen warmte en zwaartekracht, terwijl de scherpe elektroden voor intracellulaire opname gebruik maken van een combinatie van warmte, de zwaartekracht, en een motor. De procedure gebruikt om de intracellulaire opname pipetten te maken is vergelijkbaar met die gebruikt voor de injectie naalden voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder cRNA injectie in Xenopus oöcyten te maken. In het algemeen, capillaire glas <1,2 mm in diameter wordt gebruikt om de pipetten voor patch clamp opname te maken, terwijl de smallere glas wordt gebruikt voor intracellulaire opname (buitendiameter = 1,0 mm). Voor elk gereedschap, is de trekker net iets anders geprogrammeerd. Deze video laat zien hoe je beide soorten van opname pipetten met behulp van vooraf vastgestelde puller programma's.

Protocol

Pulling pipetten

Met behulp van een micro-elektrode trekker, zoals de Sutter P-97 Flaming / Brown, trek een set van ongeveer 10-20 pipetten.

  1. Selecteer uw capillaire glas. We maken gebruik van borosilicaat capillairen (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm buitendiameter, binnendiameter 1.1mm, 10cm lang). Zorgvuldig op te slaan, zodat het glas blijft schoon en stofvrij.
  2. Ontwerp een programma te trekken. We maken gebruik van een 5 stappen programma, met dalende hitte en snelheid bij elke stap, en een kleine trek aan de laatste stap. Sutter's pipet kookboek is een uitstekende referentie voor het ontwikkelen van geschikte programma's.
  3. Onderzoek de pipetpunten onder een microscoop om de opening met een diameter en gladheid te bepalen. Gooi ruw, oneffen of onregelmatig tips. Een goede trekken protocol moet ervoor zorgen dat deze zeldzaam zijn. Voor standaard patch-clamp-opname, moet tip openingen 1-3 micrometer in diameter. Een steile taper (stompe punt) leidt tot weerstand lager voor dezelfde opening diameter. Vorm en grootte kan gewijzigd worden door druk polijsten.

Brand polijsten pipetten

  1. Stel een polijsten rig (microforge) met een platina filament verwarming gecontroleerd door een voetpedaal. Een handige kit is verkrijgbaar bij ALA Scientific (CPM-2) of een soortgelijk apparaat kan stukje bij beetje worden gemonteerd.
  2. Optioneel: Smeer de pipet met een isolator aan capaciteit verminderen en verbeteren van geluid kenmerken. We maken gebruik van tandartsen. Sylgard 184 ™ (poly-dimethyl siloxaan elastomeer ook wel bekend als PDMS) is ook een optie.
  3. Bij gebruik van wax, houd een kleine gesmolten aanbod in de buurt. Met de luchtdruk op de achterkant van de pipet om de was te houden van het invoeren van de pipet, dip de punt kort in op de vloeibare was en te verwijderen. Met Sylgard, op te slaan bereid elastomeer in bevroren aliquots en verf de pipetpunt onder een microscoop. Warmte aan het elastomeer genezen.
  4. Plaats de pipet (gecoat of niet) in het polijsten apparaat en breng het uiteinde ~ 50 micron van de gloeidraad. Houd er rekening mee dat de gloeidraad zal uitbreiden bij verhitting.
  5. Aanbevolen: Volg de apart protocol voor 'druk polijsten "om de vorm van de pipet voor een optimale weerstand en tip diameter te veranderen.
  6. Een korte puls warmte (1-2 seconden) is voldoende om de was te verwijderen uit de punt van de pipet en het glas glad.
  7. Plaats de pipet eindigde in een gesloten doos om te beschermen tegen stof, herhaal dit voor een succesvolle 10 pipetten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol geïllustreerde is hier in het dagelijks gebruik in de elektrofysiologie laboratoria en wordt ook gebruikt om injectienaalden te maken voor cellen en dieren. Met een programmeerbare trekker, is het gemakkelijk om pipetten te maken voor een scala van toepassingen. Met aandacht en zorg, zal de gloeidraad op uw trekker voor een jaar of meer. Veel succes met je experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Wij bedanken de volgende financierende instanties en stichtingen voor ondersteuning: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, spierdystrofie Vereniging, de Donald B. en Delia E. Baxter Foundation, het Fonds en de Klingenstein McKnight Endowment for Neuroscience.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats