면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

Biology

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Summary

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 지질 bilyer의 위쪽 전단지에 버렸네 형성을 조절하고 TIRF 현미경을 사용하여 버렸네 형성을 시각화하는 것으로 알려진 세포 부착 단백질을 고정하는 방법을 보여줍니다.

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Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

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Abstract

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. lymphocytes와 항원 제시 세포 간의 상호 작용을 모방하기 위해, 우리는 폴리 - 히스티딘 태그 이중층의 위쪽 전단지에 재조합 세포 접착 및 MHC 단백질을 앵커로 Ni2 + - chelating의 lipids를 사용합니다. 평면 bilayers은 지방질을 준비 이중층이 형성 유리 표면을 처리하고, 다음 lymphocytes가 추가됩니다 흐름 세포를 포함하는 전문 챔버의 이중층을 형성하여 생성됩니다. 그런 다음, bilayers은 니켈과 그의 - 태그 재조합 단백질로 청구됩니다이 추가됩니다. 마지막으로, lymphocytes은 흐름 세포와 TIRF 현미경으로 주사는 이미지 버렸네 형성과 구조하는 데 사용할 수있는 제어하는​​ T 세포의 운동, 수용체 정렬의 사이트 및 수용체 저하의 사이트.

Protocol

1. lipids 준비

  1. 이중층의 상단에 전단지에 단백질을 연결하기 위해, 우리는 니켈 2를 사용 + 폴리 - 히스티딘 태그로 재조합 단백질을 고정 chelating의 lipids. 특정 세포 유형 니켈 2 + - 코팅 bilayers 이외의 특별히 준수지만, T - 세포는 일반적으로 T 세포 활성화를 공부하고이 방법이 최적 만들고하지 않습니다.
  2. 지질 이중층 솔루션은 20% 니켈 2 솔루션을 준비하여 만든 + chelating의 지질 및 클로로포름 - 메탄올 1-2 ML있는 유리관에서 해당 금액의 80 % phosphatidylcholine.
    1. 따뜻한 (30-37 ° C) 물을 욕조에서 질소 가스 스트림에서 용매를 증발. 이것은 일반적으로 십오분 주위에 걸립니다.
    2. 90 분간 lyophilizer을 사용하여 고진공 하에서 남아있는 용매를 제거합니다.
  3. 2퍼센트 혼합 세제 / 인지질 micelles의 솔루션을 만듭니다 트리스 - 생리 버퍼에 N - octyl - glucoside 세제에 lipids를 해산. 최종 인지질의 농도는 0.4 MM해야합니다. liposomes을 형성하기 위해 세제 및 양식 liposomes를 제​​거하는 트리스 - 살린 3 변경 사항에 대해이 솔루션을 dialyze. 우리는 보통 10 KDA이 떨어져 상처와 6mm 직경 스펙트럼 / 포어 # 2 튜브 1 개 ML의 순서에 볼륨과 함께 작동합니다. 우리는 튜브를 클램핑 때 어떤 공기 방울의를 제외주의합니다. 우리는 일반적으로 무균 필터이 솔루션 70 %의 에탄올 소독 장갑을 사용하여 처리하고 깨끗한 조건에서 투석을.
  4. 이 솔루션은 수정 같이 맑은해야합니다. 그것은 산화를 방지하기 위해 아르곤 가스를 아래에 저장됩니다. 솔루션 흐린있다면, 다중 벽으로 둘러싸인 vesicles가 생성되었습니다, 당신은 다시 시작해야합니다.

2. ICAM - 1 및 MHC가 평면 이중층에 예금 얼마나 많은 결정

  1. 실험을 설정하기 위해서는 ICAM - 1 및 MHC는 수용성 단백질의 특정 농도에 + chelating 이중층 니켈 2 주어진 표면 영역에 입금이 어느 정도 결정 먼저 필요합니다. 이렇게하려면, 예금 bilayers 5 마이크로 미터 직경의 유리 비즈에서 조건 하에서 단백질 솔루션 유리 비즈를 품어 그 대략적인 이미징에 사용되는 흐름 세포에 해당하고, 흐름 immunofluorometric 분석에 의해 바운드 단백질의 밀도를 읽어보십시오.
  2. 플루오레신 당 분자 알려진 숫자 FITC - 표시된 항체는 표면 바운드 단백질을 감지하는 데 사용됩니다. 플루오레신 표준 구슬은 흐름 microfluorimeter을 교정하는 데 사용됩니다.
  3. 우리는 조건을 확립 것을 대략 이들에 대한 항원 제시 ICAM - 1 200 molecules/μm2 및 I - EK - MCC91 - 103 복합 0.2-20 molecules/μm2와 세포.

3. 평면 bilayers 형성을위한 유리 커버 전표 청소

  1. 평면 bilayers은 liposomes 유리에 퓨즈 때 저절로 형성하지만 유리가 깨끗한지 경우에만.
  2. 피라 냐가 작업 때, 우리는 산성 앞치마와 무거운, 산성 모성 장갑을 포함한 전체 보호복을 착용하십시오. 조심스럽게 유기 폐기물에서 폐기물을 분리하고 적절하게 처리.
  3. 산성 피라 냐가 솔루션을 준비하려면, 마른 비커에 농축 황산의 75 ML을 추가하고, 신중하게 30 % 과산화수소 25 ML를 추가합니다. 이 솔루션은 빠른 속도로 이상 100까지 가열 ° C.
  4. 15 분 용액의 건조 coverslips 젖어. 솔루션에서 제거하고 양쪽에 잠시 물을 정화에 린스. 정화 물을 배수하기 위해 진공 소스를 사용하여 coverslips 건조. 피라 냐가 솔루션 괜찮아, 잘 퓸 후드에 표시된 캡 느슨한와 남아있는 피라 냐가 폐기물 컨테이너에 추가할 수있게 해줍니다. liposomes, coverslips, 그리고 단백질의 모든 준비가되면 면역 버렸네가 형성 될 준비가 된 것입니다.

4. bilayers을 형성

  1. bilayers을 형성하기 위해 우리 실험실 통합 난방의 장점을 가지고 Bioptechs FCSII 회의소를 사용합니다. FCSII 시스템은 스테인레스 스틸베이스입니다 함께 클램프 반대편에 유체 홈과 0.5 mm 최고 가스켓 하나의 표면에 가열을위한 인듐 주석 산화물 코팅 microaqueduct 슬라이드와 microfluidic 매니폴드, 먼지없는 0.25 mm 흐름 챔버와 피라 냐가의 높이를 정의 가스켓은 이중층이 형성되는 40mm의 원형 coverslip 청소.
  2. 이중층이 형성되는시 커버 슬립이 높은 친수성과 청소해야 할 동안 더 소수성의 경우, microacqueduct 슬라이드 실제로 잘 작동합니다. microaqueduct보다 소수성이 다음 깨끗한 물로 세척하고 완전히이 컨디셔닝 과정 후에 건조뿐만 사용 사이로 실온에서 60 분 1 % HSA로 치료에 의해 이루어집니다 만들기. 이 절차에 의해 왼쪽 변성 단백질의 코팅 리포좀 현탁액 1 μl는 원형, hemispherica를 형성하실 수 있습니다> 0.25 mm 높은 내 놓습니다.
  3. 평평한 표면 위에, 위쪽 감독 튜브, 흐름 세포 및 양식 평면 bilayers 조립 매니폴드를 배치합니다. 그런 다음 0을 넣으십시오. 그것이 평면 앉아 있는지 확인하고, 유체 튜브를 통해 위치에 구멍 5mm 개스킷. 부드럽게까지 직면하고있는 유체 채널과 개스킷에 microaqueduct 측면을 배치하고 슬라이드에 구멍이 microfluidic 튜브 정렬 것을 확인하기 전까지는 모든 하향 압력을 적용하지 않고 평면 좌석 있는지 확인하십시오. 채널은 유체 채널로 줄지어 않으며 주요 공기 공간이 없습니다되도록 microaqueduct 슬라이드의 위에 밖으로 직사각형 절단과 먼지없는 0.25 mm 개스 라이.
  4. 각 드롭 사이의 중심 - 투 - 중심 거리 2.5 mm는 그러한 패턴에 microaqueduct 슬라이드의 표면에 5 리포좀 정지 X 1 μl 방울을 넣으십시오. 5 리포좀 방울 다른 작곡있을 수 있지만,이 경우 우리는 두 bilayers, 아니 니켈이 하나의 + + chelating의 lipids와 10 % 니켈 2 + + chelating lipids의 한.을 형성합니다
  5. 이 방울이 자리에되면, 신중하게 커버 한 움직임의 표면에 아래로 살짝 놓습니다. 가능한 한 빨리 기지로 클램프. 리포좀 방울 커버 슬립과 접촉을해야합니다. bilayers가 이미 형성 이후이 연락처는 부러진해서는 안됩니다, 모든 장애는 결함이 bilayers가 발생할 수 있습니다.
  6. 현미경에 coverslip의 위치를​​ 돕기 위해 microacqueduct 슬라이드에 몇 가지 작은 잉크의 명소로 bilayers의 위치를​​ 표시하기 위해 기억하는 것이 중요합니다. 시스템이 equilibrated이 있는지 확인하기 위해 20 분이 걸립니다. 20 유연한 튜브의 cm와 3 방향 꼭지에 연결된 20 ML의 주사기를 사용하여 모든 솔루션을 전송합니다. 꼭지와 흐름 세포 사이의 죽은 볼륨을 최소화하기 위해 튜브의 짧은 길이에 의해 흐름 세포에 꼭지의 다른 포트를 연결합니다. 이 MM MgCl 2, 1 MM CaCl 2, 5 MM 포도당, 1 % 인간의 혈청 알부민을 포함한 생리 HEPES - 버퍼와 주사기를 채우십시오.
  7. 기포가가되지 않도록 프라임 관 그리고 꼭지. 흐름 세포에 이것을 연결하고 공기 방울이 이중층을 통해 전달하지 않도록 보면서 한 동작에 5 ML 통해 밀어. 지금, 당신은 bilayers을 것입니다.

작성자 :이 동영상이 문서는 "Amoeboid 로코의 테마 유사 면역 시냅스와 Kinapses 채취와 위로 헌터"을 지원 마이클 L. 더스틴 , 세포 및 발달 생물학의 연례 검토 , 볼륨 24, 2008.

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Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

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