Поддерживаемые Planar Бислои для формирования Исследование иммунологических синапсов и Kinapse

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Поддерживаемые плоского бислоя являются мощными инструментами, которые могут быть использованы для моделирования молекулярных взаимодействий в иммунологических синапсов. Здесь мы покажем, методы крепления адгезии клеток белков, известных для модуляции формирование синапса на верхний листок липидного bilyer и визуализировать формирование синапса использованием TIRF микроскопии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Поддерживаемые плоского бислоя являются мощными инструментами, которые могут быть использованы для моделирования молекулярных взаимодействий в иммунологических синапсов. Чтобы имитировать взаимодействия между лимфоцитами и антиген представляющих клеток, мы используем Ni2 +-хелатирующие липидов на якорь рекомбинантный адгезии клеток и белков ГКГ на верхний листок бислоя с поли-гистидин теги. Planar бислоев генерируются путем подготовки липидов, лечение стеклянных поверхностей, где будет бислоя форму, а затем формирование бислоя в специализированные камеры с потоком камеру, где лимфоциты будет добавлен. Затем, бислоев взимается с Ni и его с метками рекомбинантные белки не добавляются. Наконец, лимфоциты вводятся в клетку потока и TIRF микроскопия может быть использована для формирования изображения синапса и механизмов, которые контролируют передвижение Т-клеток, участков рецепторов сортировки и участки рецепторов деградации.

Protocol

1. Подготовка липидов

  1. Для того чтобы связать белки верхней листовку бислоя, мы используем Ni 2 + хелатирующие липиды, которые якорь рекомбинантных белков с поли-гистидин теги. Определенные типы клеток может присоединиться неспецифически с Ni 2 + покрытием бислоев, но Т-клетки, как правило, нет, что делает этот метод оптимальным для изучения активацию Т-клеток.
  2. Решение липидного бислоя осуществляется путем подготовки решения 20% Ni 2 + хелатирующие липидов и 80% фосфатидилхолина в соответствующих сумм в стеклянную трубку с 1-2 мл хлороформа и метанола.
    1. Evaporate растворителя в токе азота газа в теплой (30-37 ° С) водой. Это обычно занимает около 15 минут.
    2. Удалите все оставшиеся растворителя в высоком вакууме, используя лиофилизатор течение 90 минут.
  3. Растворите липидов в 2% N-октил-глюкозид моющего средства в трис-солевой буфер, который создает решения смешанных моющих средств / фосфолипидных мицелл. Конечная концентрация фосфолипидных должна быть 0,4 мм. Для формирования липосом, диализировать это решение против 3 изменений Трис-солевой удалить моющим средством и формой липосомы. Мы обычно работают с объемами порядка 1 мл с диаметром 6 мм Спектра / Пор № 2 трубки с отрезанными около 10 кДа. Мы осторожны, чтобы исключить любой ы воздушный пузырь, когда зажима труб. Мы обычно стерильных фильтров это решение и делать диализ в чистых условиях, обработка его с помощью 70% этанола стерилизовать перчатки.
  4. Это решение должно быть кристально чистым. Она хранится под аргоном для предотвращения окисления. Если раствор мутный, то несколькими стенками пузырьки были получены, и вам придется начинать сначала.

2. Определение того, сколько ICAM-1 и МНС оседают на плоских двухслойных

  1. Для того, чтобы создать эксперимент, в первую очередь необходимо определить, сколько ICAM-1 и МНС оседают на данной площади поверхности Ni 2 + хелатирующие бислоя при заданной концентрации растворимого белка. Для этого депозита бислоев на 5 микрометров бусин диаметром стекло, инкубировать стеклянные бусы с белком решений в условиях, которые приближаются к в потоке клеток, используемых для работы с изображениями, и зачитал плотность связанных белка поток immunofluorometric анализа.
  2. FITC-меченных антител с известными номерами флуоресцеина одну молекулу используются для обнаружения поверхностных связанных белков. Fluorescein стандартный бисер используется для калибровки потока микрофлуориметр.
  3. Мы создадим условия, которые приближаются к на антиген-представляющих клеток с 200 molecules/μm2 ИКАМ-1 и 0.2-20 molecules/μm2 И-Эк-MCC91-103 комплекса.

3. Очистка скользит стеклянной крышкой для формирования плоского бислоя

  1. Planar бислоев форме спонтанно, когда липосомы сливаются, стекло, но только если стекло надлежащим образом очищены.
  2. При работе с Piranha, мы носим полную защитную одежду, в том числе фартук кислоту и тяжелые, кислотостойкие рукавицы. Аккуратно отделить отходы из органических отходов и утилизировать должным образом.
  3. Для приготовления раствора кислоты Piranha, добавляют 75 мл концентрированной серной кислоты в сухой стакан и осторожно добавляют 25 мл 30% перекиси водорода. Решение быстро нагревается до температуры выше 100 ° C.
  4. Погрузите сухих покровных в раствор на 15 минут. Удалить из раствора и промыть в очищенной воде на минуту с каждой стороны. Сухие покровные использованием источника вакуума для отвода очищенной воды. Разрешить Piranha решение для охлаждения, а также добавлять в контейнер Piranha отходов, который остается с крышкой свободно, хорошо заметны в вытяжном шкафу. Когда все липосомы, покровные, и белки готовы, иммунологических синапсов готова быть сформирована.

4. Формирование бислоя

  1. Для формирования бислоев, нашей лаборатории используются Bioptechs FCSII камер, которые имеют преимущества интегрированного отопления. Система FCSII на базу из нержавеющей стали, что зажимы вместе микрожидкостных многообразие с 0,5 мм сверху прокладкой, microaqueduct слайд покрытый оксид индия и олова на отопление на одну из поверхностей, с жидкостный паз на другой стороне, без пыли 0,25 мм прокладку, которая определяет высоту камеры потока и Piranha очищены 40 мм выстрел покровное, на котором бислой образуется.
  2. Хотя покровным стеклом, на котором бислой образуется, должен быть очень гидрофильных и чистая, microacqueduct слайд на самом деле работает лучше, если это более гидрофобным. Создание microaqueduct более гидрофобных достигается, рассматривая его с 1% HSA в течение 60 минут при комнатной температуре, затем мытье с чистой водой и сушки полностью после этого процесса кондиционирования, а также между применениями. Покрытие денатурированные белки оставленные эта процедура позволяет 1 мкл липосом подвески сформировать круглые, hemisphericaл капля, которая> 0,25 мм.
  3. Чтобы собрать ячейка потока и форму плоского бислоя, место многообразие, трубы направлены вверх, на плоской поверхности. Затем поместите 0. 5 мм прокладка с отверстиями располагается над жидкостных труб, убедившись, что он сидит квартиры. Аккуратно microaqueduct стороны на прокладку жидкостных каналов вверх, и убедитесь, что места квартиру без применения каких-либо понижательное давление, пока не будет установлено, что отверстия в слайд согласования с микрожидкостных труб. Положите пыли 0,25 мм прокладка с прямоугольным вырезать в верхней части microaqueduct слайд так, чтобы канал выстроились с жидкостных каналов и Есть никаких серьезных пробелов воздуха.
  4. Место до 5 х 1 мкл капель липосомы подвески на поверхности microaqueduct слайда в рисунок так, что от центра до центра расстояние между каждой капли составляет 2,5 мм. 5 капель липосомы могут иметь различные композиции, но в этом случае мы будем только образуют две двойные слои, один, без Ni 2 + + хелатирующие липидов и один с 10% Ni 2 + + хелатирующие липидов.
  5. После того как эти капли на место, осторожно поместите покрытие скольжения вниз на поверхность в одно движение. Зажим на базу как можно быстрее. Липосомы капли должны вступить в контакт с покровным стеклом. Этот контакт не должна быть нарушена, так как бислоев, наверное, уже сформирован, любые сбои могут привести к дефектной бислоев.
  6. Важно помнить, чтобы отметить позиции бислоев с нескольких небольших пятен краски на microacqueduct слайд, чтобы помочь позиционирования покровного на микроскопе. Подождите 20 минут, чтобы убедиться, что система обладает уравновешенным. Перенесите все решения с использованием 20 мл шприца, соединенного около 20 см гибких насосно-компрессорных и 3-полосные краном. Подключите другой порт кран для проточной ячейке с помощью короткой длине трубы, чтобы минимизировать мертвый объем между краном и проточную ячейку. Заполните шприц с HEPES-солевой буфер, содержащий 2 мМ MgCl 2, 1 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы и 1% человеческого сывороточного альбумина.
  7. Премьер трубы и кран так Есть нет пузырьков воздуха. Подключите к потоке клеток и протолкнуть 5 мл в одно движение во время просмотра, чтобы убедиться, что никаких пузырьков воздуха переходит бислоя. Теперь у вас будет свой бислоев.

Это видео статьей поддерживает "Охотник на Gatherer и обратно: Иммунологические синапсов и Kinapses как вариации на тему амебоидных Locomotion" от Michael L. Дастин , Ежегодный Обзор сотового и биологии развития , том 24, 2008.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics