Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bilayers מישוריים נתמכים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לשמש מודל אינטראקציות מולקולריות בסינפסה האימונולוגית. כאן, אנו מציגים שיטות לעיגון הידבקות התא חלבונים ידועים לווסת היווצרות הסינפסה לעלון העליון של bilyer השומנים ולדמיין היווצרות הסינפסה באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bilayers מישוריים נתמכים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לשמש מודל אינטראקציות מולקולריות בסינפסה האימונולוגית. כדי לחקות את האינטראקציות בין לימפוציטים ותאים המציגים אנטיגן, אנו משתמשים Ni2 +-chelating שומנים לעגן את הידבקות התא רקומביננטי וחלבונים MHC לעלון העליון של bilayer עם מרובה היסטידין התגים. Bilayers מישורי מופקים על ידי הכנת שומנים בדם, לטיפול משטחי זכוכית שבו bilayer יהיה טופס, ולאחר מכן להרכיב את bilayer בתא מיוחד המכיל תזרים תאים לימפוציטים שבו יתווספו. ואז, bilayers מואשמים Ni וחלבונים שלו מתויג רקומביננטי מתווספים. לבסוף, לימפוציטים מוזרקים לתוך התא זרימה מיקרוסקופית TIRF יכול לשמש ליצירת תמונה סינפסה ואת המנגנונים השולטים תנועה תא T, אתרי מיון של הקולטן, ואתרים של השפלה הקולטן.

Protocol

1. הכנת שומנים

  1. על מנת לקשר חלבונים עלון העליון של bilayer, אנו משתמשים Ni 2 + שומנים chelating, אשר עוגן חלבונים רקומביננטי עם מרובה היסטידין התגים. סוגי תאים מסוימים עשויים לדבוק הלא ספציפית Ni 2 + מצופים bilayers, אבל מתאי T בדרך כלל לא, מה שהופך את השיטה האופטימלית ללימוד הפעלת תא T.
  2. הפתרון bilayer השומנים נעשית על ידי הכנת פתרון של Ni 2 + 20% שומנים ו 80 chelating phosphatidylcholine% בסכומים המתאימים שפופרת זכוכית עם 1-2 מ"ל של מתאנול, כלורופורם.
    1. להתאדות הממס תחת זרם של גז חנקן חמים (30-37 ° C) אמבט מים. בדרך כלל זה לוקח בערך 15 דקות.
    2. הסר ממס שנותרו תחת ואקום גבוה, באמצעות lyophilizer במשך 90 דקות.
  3. ממיסים את השומנים 2% N-octyl-glucoside אבקת במאגר טריס-מלוחים, אשר יוצרת פתרון של אבקת כביסה / פוספוליפידים micelles מעורבת. ריכוז פוספוליפידים הסופי צריך להיות 0.4 מ"מ. כדי ליצור ליפוזומים, dialyze פתרון זה כנגד 3 שינויים של טריס-מלוחים להסיר ליפוזומים חומרי ניקוי הטופס. אנחנו בדרך כלל עובדים עם כרכים על סדר מ"ל 1 עם 6 מ"מ קוטר צינורות ספקטרה / por 2 # עם חתך מעל סביב 10 kDa. אנחנו מקפידים להוציא את כל זה בועת אוויר כאשר clamping בצינור. אנחנו בדרך כלל סטרילי, לסנן את הפתרון הזה ולעשות את דיאליזה בתנאים נקיים, הטיפול הוא באמצעות כפפות אתנול 70% מעוקרים.
  4. פתרון זה צריך להיות ברור כשמש. זה מאוחסן תחת גז ארגון כדי למנוע חמצון. אם הפתרון הוא עכור, אז רב חומה שלפוחית ​​נוצרו, ואתה תצטרך להתחיל מחדש.

2. קביעת כמה ICAM-1 ו-MHC מופקדים על bilayer מישוריים

  1. כדי להגדיר את הניסוי, יש צורך תחילה לקבוע כמה ICAM-1 ו-MHC מופקדים על פני שטח נתון של Ni 2 + chelating bilayer בריכוז מסוים של חלבון מסיס. לשם כך, על פיקדון bilayers בקוטר 5 מיקרומטר חרוזי זכוכית, דגירה חרוזי זכוכית עם פתרונות החלבון בתנאים אלה משוער בתאי תזרים המשמש הדמיה, וקרא את הצפיפות של חלבון מחויב assay זרימה immunofluorometric.
  2. נוגדנים FITC שכותרתו עם המספרים הידועים של והעמסת לכל מולקולה המשמשים לאיתור השטח הנכנס חלבונים. והעמסת חרוזים סטנדרטיים המשמשים לכייל את microfluorimeter לזרום.
  3. נקים התנאים משוער אלה על הצגת אנטיגן תאים עם 200 molecules/μm2 של ICAM-1 ו 0.2-20 molecules/μm2 של מורכבות אני EK-MCC91-103-.

3. ניקוי מכסה מחליק זכוכית להרכיב bilayers מישוריים

  1. Bilayers מישורי בצורה ספונטנית כאשר ליפוזומים את הפתיל על זכוכית, אבל רק אם הוא ניקה את הכוס כראוי.
  2. כאשר עובדים עם Piranha, שאנו לובשים ביגוד מגן מלא, כולל סינר חומצה כבד, כפפות עמידות חומצה. בזהירות להפריד את הפסולת מפסולת אורגנית להיפטר כראוי.
  3. כדי להכין את הפתרון Piranha חומצה, להוסיף 75 מ"ל של חומצה גופרתית מרוכזת על כוס יבשה, בזהירות להוסיף 25 מ"ל של מי חמצן 30%. הפתרון מתחמם במהירות גדולה יותר כדי 100 ° C.
  4. לטבול את coverslips יבש בתמיסה במשך 15 דקות. הסר מפתרון ולשטוף ב מים מטוהרים דקה בכל צד. יבש coverslips באמצעות מקור ואקום לנקז את המים מטוהרים. אפשר פתרון Piranha להתקרר, ומוסיפים מיכל Piranha פסולת, אשר נותר עם כובע משוחרר, מסומן היטב למכסה המנוע קטר. כאשר כל ליפוזומים, coverslips, וחלבונים מוכנים, את הסינפסה האימונולוגית מוכן להיווצר.

4. יצירת bilayers

  1. כדי ליצור את bilayers, המעבדה שלנו משתמשת Bioptechs FCSII בתאי, אשר יש את היתרונות של חימום משולב. מערכת FCSII על בסיס נירוסטה מהדק יחד עם אטם סעפת microfluidic 0.5 מ"מ העליון, שקופיות microaqueduct מצופה תחמוצת אינדיום פח לחימום על משטח אחד, חריץ fluidic בצד השני, אבק ללא 0.25 מ"מ אטם המגדיר את הגובה של התא זרימה Piranha ניקה 40 מ"מ עגול coverslip שבו bilayer נוצר.
  2. בעוד פליטת לכסות, שעליו bilayer נוצר, צריך להיות הידרופילי מאוד נקי, את השקופית microacqueduct באמת עובד טוב יותר אם הוא הידרופובי יותר. ביצוע הידרופובי microaqueduct יותר מושגת על ידי טיפול זה עם HSA 1% למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם מים טהורים לחלוטין לאחר ייבוש תהליך זה אוויר, כמו גם בין השימושים. הציפוי של חלבונים מפוגל שהותירו הליך זה מאפשר 1 μl של השעיה liposome להקים עגול, hemisphericaאני טיפה כי היא> 0.25 מ"מ.
  3. כדי להרכיב את התא זרימה טופס bilayers מישוריים, המקום סעפת, עם צינורות מכוון כלפי מעלה, על משטח שטוח. ואז, במקום 0. אטם 5 מ"מ עם חורים ממוקם מעל צינורות fluidic, ולוודא כי הוא יושב בדירה. בעדינות למקום בצד microaqueduct על אטם עם ערוצי fluidic פונה כלפי מעלה, כדי לוודא שזה מושבים שטוח ללא החלת כל לחץ כלפי מטה, עד כדי לוודא את החורים שקופית ליישר עם צינורות microfluidic. הנח את אבק ללא אטם 0.25 מ"מ עם חתך מלבני על גבי השקופית microaqueduct כך הערוץ בשורה עם ערוצי fluidic ואין רווחים אוויר מרכזי.
  4. הנח עד 5 x 1 טיפות של μl ההשעיה liposome על פני השטח של השקופית microaqueduct דפוס כזה המרחק מרכז אל מרכז בין כל טיפה היא 2.5 מ"מ. 5 טיפות liposome ייתכן בהרכבים שונים, אבל במקרה הזה אנו רק יוצרים שני bilayers, אחד עם לא Ni 2 + + שומנים chelating אחד עם 10% Ni 2 + + שומנים chelating.
  5. לאחר טיפות אלה נמצאים במקום, בזהירות במקום לכסות את להחליק על משטח בתנועה אחת. קלאמפ על בסיס כמה שיותר מהר. טיפות liposome צריך ליצור קשר עם להחליק את המכסה. קשר זה לא אמור להיות שבור, מאז bilayers יש כנראה נוצרו כבר, כל השיבושים עלולים לגרום bilayers פגום.
  6. חשוב לזכור לסמן את עמדות bilayers עם כמה פצעונים קטנים הדיו בשקופית microacqueduct לסייע המיקום של coverslip על המיקרוסקופ. חכו 20 דקות כדי לוודא שהמערכת equilibrated. העברת כל הפתרונות באמצעות מזרק 20 מ"ל מחובר על 20 ס"מ של צינורות גמישים שסתום 3-way. חבר אחר הנמל שסתום אל התא זרימה לפי אורך קצר של צינורות כדי לצמצם את נפח מת בין שסתום ואת התא זרימה. מלאו את המזרק עם HEPES שנאגרו מלוחים המכיל 2 מ"מ MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 5 גלוקוז מ"מ 1% אלבומין בסרום אדם.
  7. ראש בצינור ואת שסתום ולכן אין בועות אוויר. חיבור זה אל התאים באמצעות זרם ולדחוף 5 מ"ל בתנועה אחת תוך כדי צפייה על מנת לוודא כי אין בועות אוויר לעבור מעל bilayer. כעת, תצטרך bilayers שלך.

מאמר זה הווידאו תומך "האנטר כדי לקטנים ובחזרה: סינפסות החיסונית Kinapses כמו וריאציות על נושא של תנועה Amoeboid" מאת מיכאל ל דסטין , סקירה שנתית לביולוגיה של התא ושל התפתחותית , כרך 24, 2008.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics