免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

Biology

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Summary

サポートされている平面脂質二重層は、免疫学的シナプスの分子間相互作用をモデル化するために使用できる強力なツールです。ここで、我々は、脂質のbilyerの上部のリーフレットにシナプス形成を調節し、全反射顕微鏡を用いてシナプス形成を可視化するために知られている細胞接着タンパク質を固定するための方法を示しています。

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Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

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Abstract

サポートされている平面脂質二重層は、免疫学的シナプスの分子間相互作用をモデル化するために使用できる強力なツールです。リンパ球と抗原提示細胞間の相互作用を模倣するために、我々は、ポリ - ヒスチジンタグを持つ二層の上部のリーフレットに組換え細胞接着およびMHCタンパク質を固定するNI2 +キレート脂質を使用してください。平面脂質二重層は、脂質の準備二重層が形成されるガラスの表面を処理し、リンパ球が追加されるフローセルを含む特殊なチャンバー内の二重層を形成することによって生成されます。その後、二層をNiで起訴され、Hisタグ融合組み換えタンパク質が追加されます。最後に、リンパ球は、フローセルに注入され、全反射顕微鏡は、画像のシナプス形成とメカニズム、その制御性T細胞の移動運動、受容体のソートのサイト、および受容体の劣化の部位に使用することができます。

Protocol

1。脂質の準備

  1. 二重層の上部のリーフレットにタンパク質をリンクするために、我々は、Ni 2を使用してください+キレート脂質、ポリヒスチジンタグを持つアンカー組換えタンパク質を。特定の細胞型は、Ni 2 +でコーティングされた二重層へ非特異的に付着する可能性がありますが、T細胞は、一般的にT細胞活性化を研究するためのこの方法が最適なこと、しないでください。
  2. 脂質二重層液をクロロホルム-メタノールの1〜2 mlのガラス管に適当な量のNi 2 +キレート脂質と80%のホスファチジルコリン20%の溶液を調製することによって行われます。
    1. 暖かい(30〜37℃)の水浴中で窒素ガス気流下で溶媒を蒸発させる。これは通常、約15分かかります。
    2. 90分間凍結乾燥機を使用して、高真空下で、残りの溶剤を削除します。
  3. 混合界面活性剤/リン脂質ミセルのソリューションを作成するトリス - 生理食塩水緩衝液、2%N -オクチル-グルコシドの洗剤で脂質を溶解する。最終的なリン脂質濃度は、0.4mMのはずです。リポソームを形成するために、洗剤とフォームリポソームを削除するには、トリス - 生理食塩水を3変更を避けるために、このソリューションを透析。我々は通常、10 kDaの周りのカットオフを持つスペクトラ/ POR第2配管直径6mm 1 mlの順に容量ボリュームで機能します。我々は、チューブをクランプするとき、任意の気泡のを除外するように注意です。我々は典型的には、滅菌フィルターこのソリューションおよび70%エタノール、滅菌手袋を使用してそれを処理し、クリーンな条件下での透析を行う。
  4. このソリューションでは、水晶明確にする必要があります。それは酸化を防ぐために、アルゴンガス下に格納されています。解決策が濁っている場合は、多層小胞が生成されている、と再度起動する必要があります。

2。 ICAM - 1とMHCは平面二重膜上に堆積されているどのくらいの決定

  1. 実験をセットアップするためには、可溶性タンパク質の特定の濃度でのNi 2 +キレート二重層の特定の表面積上に堆積されているどのくらいのICAM - 1とMHCを決定するためにまず必要です。 5マイクロメートル径のガラスビーズでの預金二重層、これを行うには、イメージングに使用されるフ​​ローの細胞のもの、およびフロー免疫蛍光アッセイによる結合タンパク質の密度を読み出すおおよそその条件下でのタンパク質溶液とガラスビーズをインキュベートする。
  2. フルオレセイン分子当たりの知られている番号とFITC標識抗体を表面に結合したタンパク質を検出するために使用されます。フルオレセイン標準ビーズをフローmicrofluorimeterをキャリブレーションに使用されます。
  3. 我々は、I - EK - MCC91 - 103複合体のICAM - 1の200molecules/μm2と0.2から20molecules/μm2と抗原提示細胞上のものに近似する条件を確立します。

3。平面脂質二重層を形成するためのガラスのカバースリップのクリーニング

  1. 平面脂質二重層は、リポソームがガラスに融合するときに自発的に形成するが、ガラスが適切に洗浄されている場合のみ。
  2. ピラニアで作業する場合、我々は酸のエプロンと重い、耐酸性の籠手を含む、完全な防護服を着用してください。慎重に、有機廃棄物から廃棄物を分離し、適切に処分する。
  3. 酸のピラニア溶液を調製するために、乾燥したビーカーに濃硫酸75mlのを追加し、慎重に30%過酸化水素25mlを加える。ソリューションは、急速に超えて100℃に加熱
  4. 15分間溶液中で乾燥したカバーグラスを浸し。ソリューションから削除し、それぞれの側分間精製水ですすいでください。精製水を切るために真空源を用いてカバースリップを乾かします。ピラニア溶液を冷却し、よくドラフト内でマークキャップ緩み、が残っているピラニアの廃棄物コンテナに追加することができます。リポソーム、カバーガラス、及びタンパク質のすべてが準備されている場合、免疫シナプスが形成される準備ができています。

4。二重層を形成する

  1. 脂質二重層を形成するために、私たちの研究室では、統合された加熱の利点を持っているBioptechs FCSIIチャンバーを、使用しています。 FCSIIシステムは、ステンレス製のベースになりますが一緒にクランプの反対側の流体溝と0.5ミリメートルトップガスケット、一方の表面に加熱するためのインジウムスズ酸化物で被覆microaqueductスライド、マイクロ流体マニホールド、ダストフリー0.25ミリメートルフローチャンバーとピラニアの高さを定義するガスケットは、二重層が形成されている40mmの円形のカバースリップを掃除した。
  2. 二重層が形成される際に、カバースリップは、親水性の高い、クリーンにする必要がある一方でそれはより疎水性なら、microacqueductスライドは、実際にうまく機能します。 microaqueductを作ることはより多くの疎水性は、純水で洗浄し、この調整のプロセスの後、同様の用途の間で完全に乾燥、室温で60分間、1%HSAで処理することにより達成されます。この手順によって残された変性タンパク質のコーティングは、リポソーム懸濁液を1μl、ラウンド、hemisphericaを形成することができます> 0.25 mmの高であるlのドロップ。
  3. フローセルとフォーム平面二重膜を組み立てるには、平らな表面上に、上向きに指示チューブで、マニホールドを配置。その後、0を置きます。それが平らに装着さ​​れていることを確認して、流体管の上に置く穴と5 mmのガスケット。ゆっくりと上向きに流体チャンネルとガスケットにmicroaqueduct側に配置し、スライドの穴がマイクロ流体管に合わせていることを検証するまでは、どんな下向きの圧力を適用せずにフラットシートを確認してください。チャネルが流体チャネルと揃うとは大きな空気のスペースがないことになるようにmicroaqueductスライドの上から長方形のカットでダストフリー0.25mmのガスケットを置きます。
  4. 各ドロップの中心間距離が2.5mmになるようなパターンでmicroaqueductスライドの表面に5にリポソーム懸濁液のX1μlの水滴を置きます。 5リポソーム滴は異なる組成を持つことができますが、この場合、我々は2つだけ二層、ニッケル2 + +キレート脂質および10%のNi 2 + +のキレート脂質とつのNOを持つものを形成します。
  5. これらのドロップが正しく設定されると、慎重にカバーが一つの動きの面を下にスリップ置きます。できるだけ早くベースの上にクランプ。リポソーム滴はカバースリップとの接触を確認する必要があります。脂質二重層は、おそらくすでに形成されているので、この接点は、異常はありません。すべての中断は、欠陥のある二層になることがあります。
  6. 顕微鏡のカバーの位置決めを支援するためにmicroacqueductスライド上のいくつかの小さなインクスポットのある二層の位置をマークするために覚えておくことが重要です。システムが平衡しているか確かめる為に、20分待ってください。約20フレキシブルチューブのcmおよび3方活栓に接続した20mlの注射器を使用して、すべてのソリューションを転送します。コックとフローセルの間にデッドボリュームを最小限に抑えるためにチューブの短い長さでフローセルに活栓の別のポートを接続します。 2mMのMgCl 2、1mMのCaCl 2、5mMグルコースと1%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水HEPES緩衝でシリンジを埋める。
  7. に気泡がないので素数ではチューブとコック。フローセルにこれを接続していない空気の泡が二重層を通過しないことを確認するために、見ながら一つの動きで5ミリリットルを介してプッシュ。今、あなたの二重膜を持つことになります。

条件:このビデオの記事は"アメーバロコモーションの主題による変奏曲など、免疫学的シナプスとKinapsesギャザラと戻るハンター"サポートされていますマイケルL.ダスティン細胞および発生生物学の年次レビュー 、ボリューム24、2008。

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Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

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