Soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques Etude de et Kinapse

Biology

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Summary

Soutenu bicouches planaires sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour modéliser les interactions moléculaires dans une synapse immunologique. Ici, nous montrons des méthodes pour l'ancrage des protéines d'adhésion cellulaire connue pour moduler la formation des synapses au feuillet supérieur de la bilyer lipides et de visualiser la formation des synapses en microscopie TIRF.

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Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

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Abstract

Soutenu bicouches planaires sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour modéliser les interactions moléculaires dans une synapse immunologique. Pour imiter les interactions entre les lymphocytes et les cellules présentatrices d'antigène, nous utilisons Ni2 +-chélateur lipides pour ancrer l'adhésion cellulaire recombinante et de protéines du CMH à la notice supérieure d'un bicouche avec le poly-histidine balises. Bicouches planaires sont générés par la préparation de lipides, de traiter les surfaces de verre où la bicouche vont se former, puis en formant la bicouche dans une chambre spécialisée contenant un flux de cellules où les lymphocytes sera ajouté. Ensuite, les bicouches sont facturés avec Ni et son étiquetées protéines recombinantes sont ajoutés. Enfin, les lymphocytes sont injectés dans la cellule de flux et microscopie TIRF peut être utilisé pour la formation des synapses image et les mécanismes de contrôle que la locomotion des cellules T, les sites de tri des récepteurs, et des sites de dégradation du récepteur.

Protocol

1. Préparer les lipides

  1. Afin de lier les protéines à la notice supérieure d'un bicouche, nous utilisons Ni 2 + lipides chélateurs, qui ancrent les protéines recombinantes avec des poly-histidine balises. Certains types de cellules peuvent adhérer de manière non spécifique à Ni 2 + revêtement bicouches, mais les cellules T ne sont généralement pas, ce qui rend cette méthode optimale pour l'étude de l'activation des cellules T.
  2. La solution bicouche lipidique est faite par la préparation d'une solution de 20% Ni 2 + lipides chélateurs et 80% en phosphatidylcholine les montants appropriés dans un tube en verre avec 1-2 ml de chloroforme-méthanol.
    1. Evaporer le solvant sous un courant d'azote gazeux dans un cadre chaleureux (30-37 ° C) bain-marie. Cela prend habituellement environ 15 minutes.
    2. Retirez tout solvant restant sous vide poussé, en utilisant un lyophilisateur pendant 90 minutes.
  3. Dissoudre les lipides dans les 2% de N-octyl-glucoside détergent dans Tris-buffer saline, ce qui crée une solution de détergent mélangé / phospholipides micelles. La concentration de phospholipides final devrait être de 0,4 mM. Pour former des liposomes, dialyser cette solution contre 3 changements de Tris-solution saline pour éliminer les liposomes de détergent et de forme. Nous travaillons habituellement avec des volumes de l'ordre de 1 ml avec 6 mm de diamètre Spectra / Por # 2 avec un tube coupé environ 10 kDa. Nous prenons soin d'exclure toute bulle d'air s lors du serrage de la tuyauterie. Nous généralement stériles filtre cette solution et ne la dialyse dans des conditions propres, sa manipulation avec des gants stérilisés 70% d'éthanol.
  4. Cette solution doit être limpide. Il est stocké sous gaz argon pour éviter l'oxydation. Si la solution est trouble, puis multi-parois des vésicules ont été générés, et vous devrez recommencer.

2. Déterminer combien d'ICAM-1 et CMH sont déposés sur la bicouche planaire

  1. Afin de mettre en place l'expérience, il faut d'abord déterminer combien de ICAM-1 et CMH sont déposés sur une surface donnée de Ni 2 + chélateur bicouche à une concentration donnée de protéines solubles. Pour ce faire, bicouches dépôt le 5 micromètres de diamètre des perles de verre, incuber les perles de verre avec des solutions de protéines dans des conditions qui se rapprochent de celles dans les cellules de flux utilisés pour l'imagerie, et lire la densité de protéine liée par un dosage de débit immunofluorometric.
  2. Anticorps marqués au FITC avec un nombre connu de fluorescéine par molécule sont utilisés pour détecter les protéines de surface lié. Fluorescéine perles standard sont utilisées pour calibrer les microfluorimeter débit.
  3. Nous allons créer les conditions qui se rapprochent de ceux de cellules présentatrices d'antigène avec 200 molecules/μm2 d'ICAM-1 et 0,2 à 20 molecules/μm2 de I-Ek-MCC91-103 complexes.

3. Nettoyage de la lamelles de verre pour former bicouches planaires

  1. Bicouches planaires se forment spontanément lorsque les liposomes fusionnent pour le verre, mais seulement si le verre est correctement nettoyé.
  2. Lorsque vous travaillez avec Piranha, nous portons des vêtements protecteurs complets, y compris un tablier acide et lourds, l'acide gantelets résistants. Soigneusement à trier les déchets à partir des déchets organiques et éliminer correctement.
  3. Pour préparer la solution Piranha acide, ajoutez 75 ml d'acide sulfurique concentré dans un bécher sec et ajouter prudemment 25 ml de peroxyde d'hydrogène à 30%. La solution se réchauffe rapidement jusqu'à plus de 100 ° C.
  4. Plonger les lamelles sec dans la solution pendant 15 minutes. Retirer de la solution et rincer à l'eau purifiée pour une minute de chaque côté. Sécher les lamelles à l'aide d'une source de vide pour évacuer l'eau purifiée. Laisser la solution Piranha refroidir et ajouter au conteneur de déchets Piranha, qui se retrouve avec le bouchon lâche, bien marqué dans la hotte. Lorsque toutes les liposomes, des lamelles, et les protéines sont préparés, la synapse immunologique est prêt à être formé.

4. Former les bicouches

  1. Pour former les bicouches, notre laboratoire utilise Bioptechs FCSII chambres, qui ont les avantages de chauffage intégré. Le système FCSII est sur une base en acier inoxydable qui serre ainsi un collecteur microfluidique avec un joint de 0,5 mm en haut, une diapositive microaqueduct recouvert d'oxyde d'indium-étain pour le chauffage sur une surface, avec rainure fluidiques de l'autre côté, un abri de la poussière de 0,25 mm joint qui définit la hauteur de la chambre d'écoulement et le Piranha nettoyé 40 mm rond lamelle sur laquelle la bicouche est formée.
  2. Alors que la lamelle, sur laquelle la bicouche est formée, a besoin d'être fortement hydrophile et propre, la diapositive microacqueduct fonctionne mieux si elle est plus hydrophobe. Faire le plus hydrophobe microaqueduct est réalisée par traitement avec HSA 1% pendant 60 minutes à température ambiante, puis lavage à l'eau pure et sécher complètement après ce processus de conditionnement, ainsi que entre les utilisations. Le revêtement de protéines dénaturées laissés par cette procédure permet à 1 pl de suspension de liposomes pour former un rond, hemisphericachute de L qui est> 0,25 mm de haut.
  3. Pour assembler la cellule de flux et de la forme bicouches planaires, placez le collecteur, avec les tubes dirigés vers le haut, sur une surface plane. Ensuite, placer le 0. 5 mm avec joint trous positionnés sur les tubes fluidique, en s'assurant qu'il est assis à plat. Placez délicatement le côté microaqueduct sur le joint avec les canaux fluidiques vers le haut et assurez-vous qu'il sièges plats sans appliquer aucune pression à la baisse, jusqu'à vérifier que les trous dans la lame d'aligner les tubes microfluidique. Poser la poussière 0,25 mm avec un joint de taille rectangulaire en tête de la glissière microaqueduct sorte que le canal est aligné avec les canaux fluidiques et il n'ya pas des espaces d'air important.
  4. Placez jusqu'à 5 gouttes x 1 pi de suspension de liposomes à la surface de la lame microaqueduct dans un modèle tel que la distance de centre à centre entre chaque goutte est de 2,5 mm. Le 5 gouttes liposomes peuvent avoir des compositions différentes, mais dans ce cas nous ne pourrons former deux bicouches, l'un sans Ni 2 + + lipides chélateur et un avec 10% de Ni 2 + + lipides chélateurs.
  5. Une fois ces gouttes sont en place, placer soigneusement la lamelle sur la surface en un seul mouvement. Pince sur la base aussi vite que possible. Les gouttes de liposome devrait prendre contact avec la lamelle. Ce contact ne doit pas être rompu, puisque les bicouches ont probablement déjà formé, toute perturbation peut entraîner des bicouches défectueuses.
  6. Il est important de se souvenir pour marquer les positions des bicouches avec quelques taches d'encre sur les petites diapositives microacqueduct d'aide au positionnement de la lamelle sur le microscope. Attendre 20 minutes pour s'assurer que le système a équilibré. Transférer toutes les solutions en utilisant une seringue de 20 ml connecté à environ 20 cm de tube flexible et un robinet à 3 voies. Branchez un autre port du robinet à la cellule de flux par une courte longueur de tuyau pour minimiser le volume mort entre le robinet et la cellule de flux. Remplir la seringue avec une solution saline tamponnée HEPES contenant 2 mM de MgCl2, 1 mM CaCl 2, 5 mM de glucose et 1% albumine sérique humaine.
  7. Premier de la tuyauterie et le robinet donc il n'ya pas de bulles d'air. Connectez-le à des cellules d'écoulement et de pousser à travers 5 ml dans un mouvement tout en regardant pour s'assurer qu'aucune bulle d'air passer au-dessus de la bicouche. Maintenant, vous aurez votre bicouches.

Cet article soutient la vidéo "Hunter Gatherer et Retour: Synapses immunologiques et Kinapses comme des variations sur le thème de la locomotion Bouldeur» par Michael L. Dustin , Revue annuelle de biologie cellulaire et développementale , tome 24, 2008.

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Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

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