Stöds Planar bilayers för bildandet av studier av immunologiska synapser och Kinapse

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Stöds plana bilayers är kraftfulla verktyg som kan användas för att modellera molekylära interaktioner i en immunologisk synaps. Här visar vi metoder för att förankra proteiner celladhesion kända för att modulera synaps bildning till övre bipacksedel av lipid bilyer och visualisera synaps bildning med TIRF mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stöds plana bilayers är kraftfulla verktyg som kan användas för att modellera molekylära interaktioner i en immunologisk synaps. Att efterlikna samspelet mellan lymfocyter och antigenpresenterande celler, använder vi Ni2 +-kelatbildande lipider för att förankra rekombinant cell adhesion och MHC proteiner till övre bipacksedel en tvåskiktsmembran med poly-histidin taggar. Planar bilayers genereras genom att förbereda fett, behandla glasytorna där tvåskiktsmembran kommer att bilda, och sedan bildar tvåskiktsmembran i en särskild avdelning som innehåller ett flow-cell där lymfocyterna tillkommer. Sedan är bilayers laddade med Ni och hans-märkta rekombinanta proteiner läggs till. Slutligen lymfocyter injiceras i flödet cellen och TIRF mikroskopi kan användas för att bilden synaps bildning och de mekanismer som styr T-cell förflyttning, platser av receptor sortering, och platser av receptor nedbrytning.

Protocol

1. Förbereda lipider

  1. För att länka proteiner till den övre bipacksedel en tvåskiktsmembran använder vi Ni 2 + kelatbildande lipider, som ankare rekombinanta proteiner med poly-histidin taggar. Vissa celltyper kan fastna ospecifikt till Ni 2 +-belagda bilayers, men T-celler i allmänhet inte, vilket gör denna metod optimal för att studera T-cell aktivering.
  2. Den membranet lösning gjorts genom att förbereda en lösning av 20% Ni 2 + komplexbildare fett och 80% fosfatidylkolin i lämpliga mängder i ett glasrör med 1-2 ml kloroform-metanol.
    1. Avdunsta lösningsmedel i en ström av kvävgas i en varm (30-37 ° C) vattenbad. Detta tar normalt ca 15 minuter.
    2. Ta bort eventuella återstående lösningsmedel under högt vakuum, med hjälp av en frystorkning i 90 minuter.
  3. Lös upp lipider i 2% N-Octyl-glukosid tvättmedel i Tris-saltlösning buffert, vilket skapar en lösning av blandad tvätt / fosfolipid miceller. Den slutliga fosfolipid koncentration bör 0,4 mm. Att bilda liposomer, dialyze denna lösning mot tre förändringar av tris-saltlösning för att ta bort tvättmedel och form liposomer. Vi arbetar oftast med volymer på order av 1 ml med 6 mm diameter Spectra / Por # 2 slangar med en avskuren ungefär 10 kDa. Vi är noga med att utesluta någon luftbubbla s när fastspänning av slangen. Vi brukar steril-filter denna lösning och göra dialys under rent förhållanden, hantering den med 70% etanol steriliserade handskar.
  4. Denna lösning bör vara kristallklart. Det lagras under argongas för att förhindra oxidation. Om lösningen är grumlig, då Flerväggiga blåsor har genererats, och du måste börja om igen.

2. Att bestämma hur mycket ICAM-1 och MHC deponeras på plana tvåskiktsmembran

  1. För att ställa in experimentet är det först nödvändigt att avgöra hur mycket ICAM-1 och MHC deponeras på en given yta av Ni 2 + kelatbildande tvåskiktsmembran vid en viss koncentration av lösligt protein. För att göra detta, deponera bilayers den 5 glas mikrometer diameter pärlor, inkubera glaspärlor med protein lösningar under förhållanden som tillnärma dessa i flödet celler som används för avbildning och läsa upp tätheten av proteinbundet genom ett flöde immunofluorometric analys.
  2. FITC-märkta antikroppar med ett känt antal fluorescein per molekyl används för att upptäcka ytbundet proteiner. Fluorescein standard pärlor används för att kalibrera flödet microfluorimeter.
  3. Vi kommer att skapa förutsättningar att tillnärma dessa på antigen-presenterande celler med 200 molecules/μm2 av ICAM-1 och 0,2-20 molecules/μm2 av I-Ek-MCC91-103 komplex.

3. Rengöring av glider skyddsglaset för formning plana bilayers

  1. Planar bilayers bildar spontant när liposomerna säkringen till glas, men bara om glaset är ordentligt rengjorda.
  2. När du arbetar med Piranha, bär vi full skyddskläder, inklusive en syra förkläde och tung, syrafasta handskar. Försiktigt segregerar avfallet från organiskt avfall och omhänderta ordentligt.
  3. För att förbereda lösningen syra Piranha, tillsätt 75 ml koncentrerad svavelsyra till en torr bägare och tillsätt försiktigt 25 ml 30% väteperoxid. Lösningen värms snabbt upp till högre än 100 ° C.
  4. Sänk den torra täckglasen i lösningen i 15 minuter. Ta bort från lösningen och skölj med renat vatten i en minut på varje sida. Torka täckglas med en dammsugare källa att dränera bort det renade vattnet. Låt Piranha lösningen svalna och lägg till Piranha avfallsbehållaren, som är kvar med locket löst, väl markerade i dragskåp. När alla i liposomer, täckglas, och proteiner är beredda, är den immunologiska synapsen redo att bildas.

4. Utgör bilayers

  1. Att bilda bilayers använder vårt labb Bioptechs FCSII kammare, som har fördelar av integrerad uppvärmning. Det FCSII systemet är på en rostfri bas som tvingar ihop en mikroflödessystem grenrör med en 0,5 mm topp packning, en microaqueduct bild belagda med indiumtennoxid för uppvärmning på en yta, med fluidic spåret på andra sidan, en dammfri 0,25 mm packning som definierar höjden på flödet kammaren och Piranha rengöras 40 täckglas mm runda som tvåskiktsmembran bildas.
  2. Medan locket glida, på vilken tvåskiktsmembran bildas, måste vara mycket hydrofil och ren arbetar microacqueduct bilden faktiskt bättre om det är flera hydrofoba. Göra microaqueduct flera hydrofoba uppnås genom behandling med 1% HSA i 60 minuter i rumstemperatur, sedan tvätta med rent vatten och torka fullständigt efter den här proceduren, liksom mellan användningarna. Beläggningen för denaturerad proteiner kvar av detta förfarande kan en ìl av liposomer fjädring för att bilda en runda, hemispherical droppe som är> 0,25 mm hög.
  3. Att montera flödet cellen och bildar plana bilayers, placera grenrör, med rören riktas uppåt, på en plan yta. Sedan placerar 0. 5 mm packning med hål placerat över fluidic rör, se till att den sitter plant. Placera försiktigt microaqueduct sidan på packningen med fluidic kanaler uppåt och se till att det säten platt utan att någon prispress, tills kontrollera att hålen i bilden anpassa sig till mikroflödessystem rör. Lägg dammfri 0,25 mm packningen med en rektangulär utskuren ovanpå microaqueduct bilden så att kanalen är uppradade med fluidic kanaler och det finns inga större luftrum.
  4. Placera upp till 5 x 1 l droppar av liposomer fjädring på ytan av microaqueduct bilden i ett mönster så att center-till-centrum avstånd mellan varje droppe är 2,5 mm. Den 5 liposomer droppar kan ha olika kompositioner, men i detta fall kommer vi bara bilda två bilayers, en utan Ni 2 + + komplexbildare lipider och en med 10% Ni 2 + + kelatbildande lipider.
  5. När dessa droppar är på plats, försiktigt placera locket glida ner på ytan i en rörelse. Kläm på basen så fort som möjligt. Den liposomer dropparna bör ta kontakt med locket halka. Denna kontakt bör inte brytas, eftersom bilayers har förmodligen redan bildat, eventuella störningar kan resultera i defekta bilayers.
  6. Det är viktigt att komma ihåg att markera positioner bilayers med några små bläck fläckar på microacqueduct bilden för att underlätta positionering av täckglas på mikroskopet. Vänta 20 minuter för att se till att systemet har jämvikt. Överför alla lösningar med hjälp av en 20 ml spruta kopplad till ca 20 cm av flexibla slangar och en 3-vägs kranen. Anslut en annan hamn kranen till flödet cellen genom en kort längd slang för att minimera dödvolym mellan kranen och flödet cellen. Fyll sprutan med HEPES-buffrad koksaltlösning innehållande 2 mM MgCl 2, 1 mm CaCl 2, 5 mm glukos och 1% humant serumalbumin.
  7. Prime slangen och vattenkranen så att det inte finns några luftbubblor. Anslut denna till flödet celler och driva igenom 5 ml i en rörelse medan du tittar på för att se till att inga luftbubblor passera över tvåskiktsmembran. Nu har du din bilayers.

Denna video artikeln stöder "Hunter till upptagare och Rygg: Immunologiska synapser och Kinapses som variationer på temat amöboid rörelseorgan" av Michael L. Dustin , Annual Review of Cell-och utvecklingsbiologi , Volym 24, 2008.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics