שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ'יק

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

וידאו זה מדגים כל הר אימונוהיסטוכימיה, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של אנטיגן ניתן דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי ג'יין דוד וטום Jessell.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick. J. Vis. Exp. (24), e956, doi:10.3791/956 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, הופכים אותו לכלי אידיאלי ללימוד ביטוי הנוגדן בפיתוח, המוח צינור somite עצביים. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים מכתים כל הר נוגדנים באמצעות נוגדנים HRP משני מצומדות: ראשית, העובר גזור מן הביצה ואת קבוע paraformaldehyde. Peroxidase שנית, אנדוגני הוא מובטל, העובר חשוף ואז נוגדן ראשוני. לאחר מספר שוטף, העובר הוא מודגרות עם נוגדנים משני מצומדות כדי HRP. פעילות peroxidase מתגלה באמצעות תגובה עם המצע diaminobenzidine. לבסוף, העובר מקובע ומעובד צילום חתך. היתרון של שיטה זו על השימוש של נוגדנים ניאון היא כי עוברי יכול להיות מעובד על חתך שעווה, ובכך לאפשר לימוד של אתרי אנטיגן חתך. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי ג'יין דוד וטום Jessell

Protocol

I. סקירה סכמטית:

סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים אימונוהיסטוכימיה הר שלם בעובר האפרוח. ראשית, העובר הוא קבוע PFA [IHC1]. ואז, פעילות peroxidase אנדוגני הוא הרווה [IHC2]. העובר הוא מודגרות אז הנוגדן העיקרי [IHC3]. לאחר מספר שוטף, העובר הוא מודגרות ב נוגדנים משני [IHC4]; התגובה צבע מתגלה באמצעות DAB [IHC5] ו מכתים נוגדן מופיע כתום [IHC6].

איור 1

חלק 1: תיקון העוברים

  1. כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה הר שלם על עוברי חומוס, ביצה פותח לראשונה על ידי הקשה על פגז עם מלקחיים והסרת חתיכות של הקליפה.
  2. הסר את אלבומין עבה עם מלקחיים, ו להטות את שק החלמון עם מלקחיים גס כל כך עובר את פניהם כלפי מעלה.
  3. בעזרת מספריים בסדר, לחתוך ריבוע של שק חלמון סביב העובר. מוציאים את העובר מן החלמון עם כפית, ומניחים צלחת ובה PBS.
  4. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר בזהירות את הקרומים וחלמון והעברת עובר לצלחת טרי המכיל PBS.
  5. הצמד את העובר למטה עם מלקחיים וסיכות חרקים, ואת לשאוב PBS. החלף את זה עם PFA 4% ב-PBS, ומאפשרים לעובר לתקן 1h ב RT.

חלק 2: עוברים הכנות לקראת השלב נוגדן

  1. כדי למזער את זיהום מיקרוביאלי פוטנציאל, להשתמש DDH 2 O בכל השלבים הבאים.
  2. לאחר העובר הוא קבוע, לשאוב את הפתרון מקבע ועושה כראוי כמו פסולת כימית. מלאו את המנה עם PBS.
  3. הבא, בעזרת סכין microdissection, לחתוך ריבוע סביב העובר להסיר ממברנות extraembryonic. הסר סיכות חרקים עם מלקחיים.
  4. לאחר סיכות הוסרו, להשתמש סוף קהה פיפטה פסטר להעביר את העובר כדי בקבוקון המכיל scintillation עם PBT (PBS pH 7.4, טריטון X 0.5%).
  5. לשטוף את העובר עם PBT, 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
  6. הסר PBT מבקבוקון הנצנץ, ולהחליף PBTx המכיל 0.3% H 2 O 2 כדי להשבית peroxidase אנדוגני פוטנציאליים.
  7. דגירה עבור שעה 2 ב RT על nutator.
  8. לשטוף עם העובר PBT, 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן 3 פעמים במשך 30 דקות כל אחד.

חלק 3: דגירה נוגדן

  1. כדי להכתים את העובר עם נוגדנים, להתחיל לשטוף את העובר במשך שעה אחת במאגר חסימה או 1% BSA / NGS 1% / PBT (אנו משתמשים NGS כי נוגדנים משני גדל עז). לדגור על nutator למשך שעה אחת ב RT.
  2. לדלל את הנוגדן העיקרי 01:01 במאגר חוסם, ואת העובר דגירה בפתרון זה עבור 2 ימים 4 ° C על nutator. הגורם העיקרי דילול נוגדן תלוי בבחירת הנוגדן הראשוני. כאן, אנו משתמשים נוגדן מן התפתחותית מחקרים Hybridoma הבנק, אשר כאמור supernatent. אנו לדלל אותה 01:01 בחסימת חיץ.
  3. הבא, לבצע 3 10 דקות שוטף ב PBT, ואחריו 3 1 שעות שוטף של PBT.
  4. לאחר כביסה, לדלל את הנוגדן 1:2500 משני חיץ חוסם (במקרה זה peroxidase מצומדות-עיזים אנטי עכבר IgG (H + L), ו העובר דגירה בפתרון זה O / N ב 4 ° C על nutator.
  5. בצעו 3 10 דקות שוטף ב PBT, ואחריו 3 1 שעות שוטף ב PBT.

חלק 3: תגובת צבע

  1. כדי לפתח את התגובה צבע של העובר מוכתם, תחילה לבצע 2 20 דקות שוטף של טריס חיץ (100mm טריס HCl, pH 7.4).
  2. בינתיים לפזר מצע DAB (3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride) ב טריס חוצץ ב 500μg/ml מתחת למכסה המנוע קטר; לשמור על פתרון בחושך, על הקרח.
  3. הסר האחרון לשטוף טריס חיץ מן העובר בקבוקון המכיל ולהחליף פתרון DAB 5 מ"ל משלב 3.2. שמור בחושך על nutator עבור 20 mn. השלך Eppendorf קצה בדלי המכיל פתרון אקונומיקה 10% על מנת לטהר DAB.
  4. בינתיים להכין המניה 0.3% H 2 O 2 ב DH 2 O על הקרח.
  5. הוסף מניות 50μl H 2 O 2 ל בקבוקון המכיל עוברים DAB. שמור בחושך. אחרי 1-2 דקות, לפקח התגובה תחת מיקרוסקופ.

חלק 4: עיבוד העובר על צילום היסטולוגיה

  1. כאשר התגובה צבע הושלמה, להיפטר DAB בדלי אקונומיקה. החלף עם 5 מ"ל מים מהברז.
  2. בצע 2 10 דקות שוטף ב PBS.
  3. כדי תהליך הצילום חתך שעווה, מייבשים בסדרה אתנול (25%, 50%, 75% ו 100%) במשך 10 דקות כל אחד.
  4. החלף את אתנול עם 0.5-1 מ"ל שמן עץ הארז (זה יהפוך את השקוף העובר). תהליך לצילום בשמן עץ ארז.
  5. בעקבות הצילום, לחזור אל העובר בקבוקון ולהחליף את שמן עץ ארז עם 100% אתנול. חזור על שלב אתנול.
  6. החלף דוארthanol עם FCF 5% ירוק מהיר ב 100% אתנול, ו דגירה במשך 3 דקות (שלב זה יגרום עוברים גלוי עבור היסטולוגיה). החלף פתרון מהיר ירוק FCF עם 100% אתנול ו תהליך היסטולוגיה.

נציג תוצאות:

איור 2

בדוגמאות להלן, עוברים הם גזור בשלבים HH 10 (א), 12 (ב) ו -11 (ג); עוברים להראות ביטוי PAX 7 ב crestas עצביים המתעוררים גם somites ו בצינור העצבי (A, B); ב (ג), notochord התווית 15.3B9 (לא-1) (נוגדנים הניתנים על ידי התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בביצוע כל הר מכתים נוגדן בעוברים אפרוח צעיר. פרוטוקול זה משמש בעיקר לאפיון במרחב ובזמן של נוגדנים הרומן חומוס 2,3, כמו גם לשימושם של סמנים antigenic ידוע כדי לקבוע מומים עובריים הבאים להעליב 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

נוגדנים חד שבטיים (15.3B9, PAX7) שפותח על ידי (J. Dodd, TM Jessell וא Kawakami) התקבלו בנק Hybridoma מחקרים התפתחותיים שפותחה בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה מדעים ביולוגיים , איווה. DP הוא חתן פרס רות Kirschstein DA021977 1F32-01A1 מן המכון הלאומי האמריקני לשימוש בסמים. עבודה זו נתמכה על ידי מ 'מרגרט Alkek קרן אל RHF.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Charles River Laboratories Premium Fertile Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator Other Lyon RX
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Forceps (2) Tool Fine Science Tools 11002-13
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Plastic dishes Tool Falcon BD 353001
Rubber Bulb Tool Electron Microscopy Sciences 70980
Pasteur Capillary Pipette Tool Electron Microscopy Sciences 70950-12 round edge under flame
Microdissecting knife Tool Fine Science Tools 10056-12 Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
30% H2O2 Reagent Sigma-Aldrich H1009
BSA Reagent Sigma-Aldrich A3803
NGS Reagent Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Primary Antibodies Reagent Developmental Studies Hybridoma Bank 4G11, 15.3B9, PAX7 For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Reagent Jackson ImmunoResearch 115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride Reagent Pierce, Thermo Scientific 34001 Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.
Cedar wood oil Reagent Sigma-Aldrich W522503
Fast green FCF Reagent Sigma-Aldrich F7252
Minuten pins 0.2mm diam Fine Science Tools 26002-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
  2. Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
  3. Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
  4. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).

Comments

1 Comment

  1. How can I see your experimental video?

    Reply
    Posted by: sanjoy c.
    August 29, 2012 - 10:46 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics