संग्रह और माप शल्य घाव में nociceptive और सूजन मध्यस्थों

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Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

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Abstract

इस अध्ययन के उद्देश्यों के लिए इकट्ठा करने और मापने शल्य साइट पर भड़काऊ और nociceptive जैव रासायनिक मध्यस्थों की व्यवहार्यता का परीक्षण किया गया, घाव और सीरम स्तरों के बीच संबंधों का मूल्यांकन, और किसी भी मध्यस्थ रिलीज, दर्द और एनाल्जेसिक के बाद सीजेरियन की खपत के बीच संघों का निर्धारण डिलीवरी. बीस स्वस्थ रीढ़ की हड्डी संज्ञाहरण के साथ वैकल्पिक सीजेरियन प्रसव के दौर से गुजर महिलाओं दाखिला लिया. Exudate और सीरम मध्यस्थों घाव, दर्द स्कोर और दर्दनाशक दवाओं की खपत 1, 6, 24, और 48 के बाद सिजेरियन घंटे में मापा गया. घाव exudate, 20 मध्यस्थों के बाहर 19 मज़बूती आईएल 1β, आईएल -2, आईएल -4, आईएल -6, आईएल -7, आईएल -8, आईएल -10, आईएल -12, आईएल 13, आईएल सहित पाया गया -17, TNFα, INFγ, G-CSF, जीएम-CSF, MCP-1 और एमआईपी - 1β, तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF), प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (पीजी-E2) और मादक पी. पीजी-E2 घाव और विभिन्न साइटोकिन्स जल्दी नुकीला जबकि NGF एक और अधिक देरी रिहाई से पता चला है. एकाग्रता बनाम घाव और सीरम साइटोकिन्स के समय प्रोफाइल के बीच कोई सहसंबंध थे. इस अध्ययन इकट्ठा करने और मापने विशिष्ट समय बिंदुओं पर nociceptive और शल्य घाव में सूजन मध्यस्थों की व्यवहार्यता को दर्शाता है. घाव और सीरम स्तरों के बीच महत्वपूर्ण correlations के अभाव साइट विशेष रिलीज निर्धारण अगर स्थानीयकृत विकृतियों के लिए अध्ययन किया जा के महत्व पर जोर दिया.

Protocol

Nociceptive और भड़काऊ जैव रासायनिक मध्यस्थ संग्रह

  1. ऑन - क्यू PainBuster ® ® दर्द राहत सिस्टम उपचर्म परत में शल्य चिकित्सा टीम द्वारा डाला जाता है बस से पहले बंद घाव. प्रणाली लगातार subcutaneously 2 मिलीग्राम / एच. के एक दर पर घाव में सामान्य नमक (या स्थानीय संवेदनाहारी) उद्धार
  2. एक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी इस प्रणाली में शामिल है निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर घाव exudate की आकांक्षा की अनुमति.
  3. प्रोटोकॉल (जैसे, 1, 6, 24, और सीजेरियन प्रसव के बाद 48 घंटे) द्वारा निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर, घाव exudate के 1 मिलीलीटर proteinase अवरोध करनेवाला के 30 μl युक्त एक polyethylene कप में वापस ले लिया है.
  4. एक ही समय के अंतराल पर रक्त के 10 मिलीलीटर एक हरे रंग की शीर्ष रक्त संग्रह लिथियम हेपरिन युक्त ट्यूब में एकत्र किया जाता है. Proteinase अवरोध करनेवाला के 300 μl तब रक्त के नमूनों को जोड़ा जाता है.
  5. संग्रह के 1 घंटे के भीतर, बर्फ पर नमूने डाल रहे हैं और 10 मिनट के लिए 3000 rpm पर centrifuged.
  6. सीरम और घाव supranate हटा दिया है और जगह एक मानक microcentrifuge ट्यूब में और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत

परख विश्लेषण

  1. एक बार सभी के नमूने एकत्र कर रहे हैं, वे thawed और एक ही समय में विश्लेषण कर रहे हैं.
  2. साइटोकिन्स तो A17 मल्टीप्लेक्स मनका सरणी immunoassay प्लेट का उपयोग करके मापा जाता है. मल्टीप्लेक्स प्रौद्योगिकी इम्युनो - परख 100 analytes करने के लिए शरीर के तरल पदार्थ के रूप 50 μl और एलिसा के साथ प्राप्त उन लोगों के साथ तुलनीय परिणाम उपज के रूप में मात्रा में छोटे नमूनों में परख करने की क्रिया की अनुमति देता है. यह थाली इंटरल्यूकिन (आईएल 1ß) 1ß, 2 इंटरल्यूकिन (आईएल 2), 4 इंटरल्यूकिन (आईएल -4), 5 इंटरल्यूकिन (आईएल -5), 6 इंटरल्यूकिन (आईएल -6), इंटरल्यूकिन 7 (आईएल को मापने में सक्षम है -7), 8 इंटरल्यूकिन (आईएल -8), इंटरल्यूकिन (आईएल -10), इंटरल्यूकिन 12 (आईएल -12), 13 इंटरल्यूकिन (आईएल 13), 17 इंटरल्यूकिन (आईएल -17), ट्यूमर परिगलन कारक α (TNFα) इंटरफेरॉन (INFα) α, granulocyte कॉलोनी उत्तेजक कारक (G-CSF), granulocyte-बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-CSF), monocyte chemoattractant प्रोटीन 1 (MCP-1) और बृहतभक्षककोशिका भड़काऊ प्रोटीन 1 (एमआईपी 1β).
  3. तंत्रिका वृद्धि कारक NGF DY256 एंटीबॉडी के साथ 17-plex थाली करने के लिए यह जैव Plex amine युग्मन किट की सहायता के साथ जोड़कर मापा जाता है.
  4. प्रत्येक माप डुप्लिकेट में किया जाता है और निर्माता की विनिर्देश के अनुसार. प्रत्येक analyte के लिए मानक घटता 0.20, 0.78 की सांद्रता, 3.13, 12.5, 50, 200, 800, स्नातकोत्तर 3200 / मिलीलीटर से अधिक एक शून्य मानक (सामान्य नमक केवल) पर संदर्भ निर्माताओं द्वारा आपूर्ति analytes का उपयोग करके उत्पन्न कर रहे हैं. मानक घटता प्रत्येक समय में शामिल हैं और नमूना सांद्रता जैव Plex प्रबंधक सॉफ्टवेयर के साथ गणना की गई.
  5. प्रोस्टाग्लैंडीन E2 और पदार्थ पी अत्यधिक संवेदनशीलता एलिसा किट प्रत्येक परख दो प्रतियों में निर्माता की विनिर्देश के अनुसार किया जाता है का उपयोग करके मापा जाता है.

    चित्रा 1
    चित्रा 1

    चित्रा 1: विभिन्न समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स (इंटरल्यूकिन (आईएल 1ß) 1ß, 2 इंटरल्यूकिन (आईएल -2), 4 इंटरल्यूकिन (आईएल -4), 5 इंटरल्यूकिन (आईएल -5), इंटरल्यूकिन exudate और सीरम का स्तर 6 (आईएल -6), 7 इंटरल्यूकिन (आईएल -7), 8 इंटरल्यूकिन (आईएल -8), इंटरल्यूकिन (आईएल -10), 12 इंटरल्यूकिन (आईएल -12), 13 इंटरल्यूकिन (आईएल 13), 17 इंटरल्यूकिन (आईएल -17), ट्यूमर परिगलन कारक (TNF-α) α, γ इंटरफेरॉन (INFγ), granulocyte कॉलोनी उत्तेजक कारक (G-CSF), granulocyte-बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-CSF), monocyte chemoattractant प्रोटीन 1 (MCP-1 ) और बृहतभक्षककोशिका भड़काऊ प्रोटीन 1 (एमआईपी 1ß), तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF), प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (पीजी-E2) और पदार्थ पी (सपा) (स्नातकोत्तर / एमएल) के स्तर आधारभूत पर मापा, 6 और 24 घंटे बाद सिजेरियन प्रसव .

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Discussion

पर क्यू PainBuster ® ® दर्द राहत सिस्टम उपचर्म परत में पूरे चीरा भर में डाला जाना चाहिए बस से पहले बंद घाव. यह निर्दिष्ट समय अंतराल पर तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी के माध्यम से आकांक्षा की सुविधा. ऑन - क्यू ® प्रणाली लगातार सामान्य खारा subcutaneously 2 मिलीग्राम / एच. के एक दर पर घाव में उद्धार इस कैथेटर के थक्के रोकता है और exudate नमूनों का उत्पादन प्रणाली की विश्वसनीयता में सुधार. यदि exudate की आकांक्षा (मामलों की लगभग 5%) मुश्किल है, विषय की स्थिति को बदलने (जैसे, रोगी बैठे या उन्हें फ्लैट झूठ बोल), घाव ऊपर धीरे से धक्का, एक 0.5 1ml सामान्य खारा फ्लश का उपयोग या कैथेटर वापस लेने पर विचार 1-2 सेमी.

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Acknowledgements

डॉ. कार्वाल्हो काम महिला स्वास्थ्य और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बाल स्वास्थ्य और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (HD043452 5K12) के मानव विकास पर अनुसंधान के कार्यालय से महिलाओं के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान में एक बिल्डिंग अंतःविषय करियर द्वारा समर्थित है. डॉ. आक्रोश के लिए (ऑन - क्यू ® PainBuster ® पोस्ट-op दर्द राहत सिस्टम) की आपूर्ति और धन प्राप्त मैं फ्लो से (झील वन, सीए) जैव रासायनिक assays का आयोजन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

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References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
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  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

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