Att samla in och mäta nociceptiv och inflammatoriska mediatorer i kirurgiska sår

Biology

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Målen för denna studie var att testa möjligheterna att samla in och mäta inflammatoriska och nociceptiv biokemiska mediatorer i operationsområdet, för att utvärdera förhållandet mellan såret och serum, och för att fastställa eventuella samband mellan medlaren release, smärta och smärtstillande konsumtion efter kejsarsnitt leverans. Tjugo friska kvinnor som genomgår elektiv kejsarsnitt med spinal anestesi inkluderades. Sårvätska och serum medlare, poäng smärta och analgetika konsumtion mättes vid 1, 6, 24 och 48 timmar efter kejsarsnitt. I sårvätska, var 19 av 20 medlare upptäckas tillförlitligt inklusive IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL -17, TNF, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 och MIP-1β, nerv tillväxtfaktor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) och substans P. Wound PG-E2 och olika cytokiner nådde tidigt , medan NGF visade en mer fördröjd frisättning. Det fanns inga samband mellan koncentrationen mot tiden profil sår och serum cytokiner. Denna studie visar på möjligheterna att samla in och mäta nociceptiv och inflammatoriska mediatorer i kirurgiska sår vid specifika tidpunkter. Avsaknaden av signifikanta korrelationer mellan såret och serum betonar vikten av att fastställa platsspecifika utsläppet om lokaliserade sjukdomstillstånd ska studeras.

Protocol

Nociceptiv och inflammatoriska biokemiska medlare samling

  1. On-Q ® PainBuster ® Smärtlindring systemet sätts in i den subkutana vävnaden av kirurgerna, strax före tillslutning av sår. Systemet levererar kontinuerligt koksaltlösning (eller lokalbedövning) subkutant i såret med en hastighet av 2 ml / h.
  2. En trevägskran ingår i detta system så att aspiration av sårsekret vid specificerade tidpunkter.
  3. Vid tidpunkter som angetts av protokoll (t ex 1, 6, 24 och 48 timmar efter kejsarsnitt) är 1 ml sårvätska dras upp i en polyetylen kopp innehåller 30 ìl proteinas hämmare.
  4. Samtidigt intervall 10 ml blod samlas i en grön topp provröret som innehåller litium heparin. 300 ìl proteinas hämmare läggs sedan till blodprov.
  5. Inom en timme efter insamling, prover på is och centrifugeras vid 3000 rpm i 10 min.
  6. Serum och såret supranate tas bort och placera i en standard mikrocentrifugrör och förvaras vid -20 ° C.

Analys analys

  1. När alla prover samlas in, de är tinade och analyseras på samma gång.
  2. Cytokiner är sedan mäts med A17-multiplex pärla plattan array immunoassay. Multiplex immuno-assay teknik kan testmetoder för upp till 100 analyter i kroppen vätska prover så små i volym som 50 l och ger resultat som är jämförbara med dem som erhålls med ELISA. Denna platta kan mäta interleukin 1ß (IL-1ß), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5), interleukin 6 (IL-6), interleukin 7 (IL -7), interleukin 8 (IL-8), interleukin (IL-10), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 17 (IL-17), tumörnekrosfaktor α (TNF) , interferon α (INFα), granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF), granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF), monocyter chemoattractant protein 1 (MCP-1) och makrofag inflammatoriska protein 1 (MIP-1β).
  3. Nervtillväxtfaktor mäts med NGF antikroppar DY256 genom att lägga till 17-Plex plattan med hjälp av Bio-Plex amin koppling kit.
  4. Varje mätning är gjord i dubbletter och enligt tillverkarens specifikation. Standard kurvorna för varje analyt genereras med hjälp av den referens analyter som tillhandahålls av tillverkarna i koncentrationer på 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml plus en nolla standard (fysiologisk koksaltlösning endast). Standardkurvor ingår i varje körning och prov koncentrationer beräknades med Bio-Plex Manager.
  5. Prostaglandin E2 och substans P mäts med en mycket känslig ELISA-kit Varje analys görs i två exemplar enligt tillverkarens specifikation.

    Figur 1
    Figur 1

    Figur 1: sårvätska och serumnivåer av olika pro-och anti-inflammatoriska cytokiner (interleukin 1ß (IL-1ß), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5), interleukin 6 (IL-6), interleukin 7 (IL-7), interleukin 8 (IL-8), interleukin (IL-10), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 17 (IL -17), tumörnekrosfaktor α (TNF-α), interferon γ (INFγ), granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF), granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF), monocyter chemoattractant protein 1 (MCP-1 ) och makrofag inflammatoriska protein 1 (MIP-1ß), nervtillväxtfaktor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) och substans P (SP)-nivåer (pg / ml) mätt vid baseline, 6 och 24 timmar efter kejsarsnitt .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

On-Q ® PainBuster ® Smärta system bör införas över hela snittet i subkutana vävnaden strax före tillslutning av sår. Detta underlättar strävan via trevägskran vid bestämda tidpunkter. On-Q ®-system levererar kontinuerligt koksaltlösning subkutant i såret med en hastighet av 2 ml / h. Detta förhindrar att katetern koagulering och förbättrar tillförlitligheten i systemet för att producera exsudat prover. Om aspiration av sårvätska är svårt (ca 5% av fallen), överväga att ändra motivets position (t.ex., sitter patienten upp eller ligger dem platt), pressa försiktigt över såret med en 0,5-1ml koksaltlösning spola eller dra tillbaka katetern 1-2 cm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Dr Carvalho arbete stöds av en byggnad Tvärvetenskap Karriär i kvinnors hälsa forskningsanslag från Office of Forskning om kvinnors hälsa och National Institute of Child Health och Human Utveckling av National Institutes of Health (5K12 HD043452). Dr Angst fick förnödenheter (On-Q ® PainBuster ® Post-Op Smärtlindring System) och finansiering för att genomföra de biokemiska analyser från I-Flow (Lake Forest, Kalifornien).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
  2. Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics