La recogida y medición de mediadores inflamatorios y nociceptivos en las heridas quirúrgicas

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Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

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Abstract

Los objetivos de este estudio fue probar la viabilidad de la recogida y medición de mediadores bioquímicos inflamatorios y nociceptivos en el sitio quirúrgico, para evaluar la relación entre la herida y los niveles séricos, y determinar las asociaciones entre la liberación de mediadores, el dolor y el consumo de analgésicos post-cesárea entrega. Veinte mujeres sanas sometidas a cesárea electiva con anestesia espinal se inscribieron. Exudado de la herida y los mediadores de suero, las puntuaciones de dolor y el consumo de analgésicos se mide a 1, 6, 24 y 48 horas post-cesárea. En el exudado de la herida, 19 de los 20 mediadores se detectaban correctamente incluyendo IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL -17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 y MIP-1β, factor de crecimiento nervioso (NGF), la prostaglandina E2 (PG-E2) y la sustancia P. heridas PG-E2 y diversas citocinas alcanzó su punto máximo a principios , mientras que el NGF mostró una liberación más retardada. No hubo correlación entre la concentración frente al perfil temporal de la herida y citocinas séricas. Este estudio demuestra la viabilidad de la recogida y medición de mediadores inflamatorios y nociceptivos en las heridas quirúrgicas en momentos específicos. La falta de correlaciones significativas entre los niveles séricos de la herida y hace hincapié en la importancia de determinar el sitio específico de patologías localizadas en libertad si se van a estudiar.

Protocol

Colección bioquímicos mediador inflamatorio y nociceptivo

  1. El On-Q ® PainBuster ® sistema de alivio del dolor se inserta en la capa subcutánea por el equipo quirúrgico justo antes de cierre de la herida. El sistema proporciona continuamente una solución salina normal (o anestesia local) por vía subcutánea en la herida a una velocidad de 2 ml / h.
  2. Una llave de tres vías se incorpora a este sistema para permitir la aspiración de exudado de la herida en los puntos de tiempo especificado.
  3. En los puntos de tiempo especificado por el protocolo (por ejemplo, 1, 6, 24 y 48 horas después del parto por cesárea), 1 ml de exudado de la herida se retira en una taza de polietileno conteniendo 30 l de inhibidor de la proteasa.
  4. Al mismo tiempo, los intervalos de 10 ml de sangre se recoge en un tubo superior verde de recogida de sangre que contiene heparina de litio. 300 l de inhibidor de la proteasa se añade a las muestras de sangre.
  5. Dentro de 1 hora de la recolección, las muestras se colocan en hielo y se centrifuga a 3000 rpm durante 10 minutos.
  6. El suero y supranate herida se elimina y el lugar en un tubo de microcentrífuga estándar y se almacenan a -20 ° C.

Ensayo de análisis

  1. Una vez que las muestras sean tomadas, que se descongelan y se analizan al mismo tiempo.
  2. Las citoquinas son medidos usando A17-multiplex placa cordón inmunoensayo matriz. Multiplex inmuno-ensayo tecnología permite ensayar hasta 100 analitos en las muestras de fluidos corporales como de pequeño volumen de 50 l, y producir resultados comparables con los obtenidos por ELISA. Esta placa es capaz de medir la interleucina 1ß (IL-1ß), la interleucina 2 (IL-2), la interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), la interleucina 6 (IL-6), la interleuquina 7 (IL -7), la interleucina 8 (IL-8), la interleuquina (IL-10), la interleuquina 12 (IL-12), la interleuquina 13 (IL-13), la interleuquina 17 (IL-17), factor de necrosis tumoral α (TNF) , el interferón α (INFα), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), granulocitos y macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) y la proteína inflamatoria de los macrófagos 1 (MIP-1β).
  3. Factor de crecimiento nervioso se mide con el anticuerpo NGF DY256 añadiéndolo a la placa de 17 complejos con ayuda del kit de amina Bio-Plex de acoplamiento.
  4. Cada medición se realiza por duplicado y de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Las curvas de calibración para cada analito se generan mediante el uso de los analitos de referencia facilitada por los fabricantes en concentraciones de 0.20, 0.78, 3.13, 12.5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml más un cero estándar (solución salina normal solamente). Las curvas de calibración se incluyen en cada carrera y las concentraciones de la muestra se calculó con el software de Administrador de Bio-Plex.
  5. La prostaglandina E2 y la sustancia P se miden con una gran sensibilidad kits de ELISA se lleva a cabo cada ensayo por duplicado, de acuerdo a las especificaciones del fabricante.

    Figura 1
    Figura 1

    Figura 1: Los niveles de exudado y el suero de diversas citoquinas pro-y anti-inflamatorios (interleucina 1ß (IL-1ß), la interleucina 2 (IL-2), la interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), la interleucina 6 (IL-6), la interleuquina 7 (IL-7), la interleucina 8 (IL-8), la interleuquina (IL-10), la interleuquina 12 (IL-12), la interleuquina 13 (IL-13), la interleuquina 17 (IL -17), factor de necrosis tumoral α (TNF-α), interferón γ (INFγ), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), granulocitos y macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF), la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1 ) y la proteína inflamatoria de los macrófagos 1 (MIP-1ß), factor de crecimiento nervioso (NGF), la prostaglandina E2 (PG-E2) y la sustancia P (SP) niveles (pg / mL) medidos al inicio, 6 y 24 horas post-parto por cesárea .

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Discussion

El On-Q ® PainBuster Dolor ® Sistema de seguridad deben ser insertados a través de toda la incisión en la capa subcutánea justo antes de cierre de la herida. Esto facilita la aspiración a través de la llave de tres vías en los intervalos de tiempo especificados. El On-Q ® sistema de forma continua proporciona una solución salina normal por vía subcutánea en la herida a una velocidad de 2 ml / h. Esto evita que el catéter de la coagulación y mejora la fiabilidad del sistema para producir muestras de exudado. Si la aspiración de exudado es difícil (aproximadamente el 5% de los casos), considere cambiar la posición del sujeto (por ejemplo, sentarse al paciente o acostada a plano), presionando suavemente sobre la herida, con un 0,5-1ml de solución salina normal o retirar el catéter 1-2 cm.

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Acknowledgements

El trabajo del Dr. Carvalho se apoya en un edificio Carrera Interdisciplinaria de conceder Salud de la Mujer de investigación de la Oficina de Investigación en Salud de la Mujer y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud (5K12 HD043452). Angustia Dr. recibieron suministros (el on-Q ® PainBuster ® Post-Op Sistema de Alivio del Dolor) y la financiación para la realización de los ensayos bioquímicos de I-Flow (Lake Forest, CA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

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References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
  2. Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

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