Sammeln und Messen Nozizeptive und Entzündungsmediatoren in chirurgische Wunden

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Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

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Abstract

Die Ziele dieser Studie waren die Durchführbarkeit der Erhebung und Messung entzündlichen und nozizeptiven biochemischen Mediatoren an der Operationsstelle zu testen; die Beziehung zwischen Wunde und Serumspiegel zu bewerten; und zu Assoziationen zwischen Mediatorfreisetzung, Schmerzen und Schmerzmittel Verbrauch nach Kaiserschnitt bestimmen Lieferung. Zwanzig gesunde Frauen nach elektiven Kaiserschnitt mit Spinalanästhesie wurden eingeschlossen. Wundexsudat und Serum Mediatoren, Schmerz-Scores und Analgetika Konsum wurden nach 1, 6, 24 und 48 Stunden nach der Kaiserschnitt gemessen. In Wundexsudat, wurden 19 von 20 Mediatoren zuverlässig wie IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL erkannt -17, TNF, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 und MIP-1β, nerve growth factor (NGF), Prostaglandin E2 (PG-E2) und Substanz P. Wound PG-E2 und verschiedene Zytokine erreichte Anfang , wohingegen NGF zeigten eine verzögerte Freisetzung. Es gab keine Korrelation zwischen der Konzentration-Zeit-Profil von Wund-und Serum-Zytokine. Diese Studie zeigt die Machbarkeit der Erfassung und Messung von nozizeptiven und Entzündungsmediatoren in Operationswunden zu bestimmten Zeitpunkten. Das Fehlen von signifikanten Korrelationen zwischen Wunde und Serumspiegel betont die Bedeutung der Bestimmung ortsspezifische Freisetzung, wenn lokalisierten Erkrankungen untersucht werden sollen.

Protocol

Nozizeptiven und entzündlichen biochemischen Vermittler Sammlung

  1. Die On-Q ® PainBuster ® Pain Relief-System ist in die subkutane Schicht durch das OP-Team kurz vor dem Wundverschluss eingefügt. Das System liefert kontinuierlich physiologische Kochsalzlösung (oder örtliche Betäubung) subkutan in die Wunde mit einer Rate von 2 ml / h.
  2. Ein Drei-Wege-Hahn ist in dieses System integriert, um eine Aspiration von Wundexsudat zu bestimmten Zeitpunkten zu ermöglichen.
  3. Zu den Zeitpunkten durch das Protokoll (z. B. 1, 6, 24 und 48 Stunden nach Kaiserschnitt) angegeben, wird 1 ml Wundexsudat in eine Pfanne aus Polyethylen mit 30 ul Proteinase-Inhibitor zurückgezogen.
  4. Zur gleichen Zeitintervallen von 10 ml Blut in eine grüne Spitze Blutentnahmeröhrchen mit Lithium-Heparin gesammelt. 300 ul Proteinase-Inhibitor wird dann an den Blutproben aufgenommen.
  5. Innerhalb von 1 Stunde nach der Entnahme werden die Proben auf Eis gelegt und zentrifugiert bei 3000 rpm für 10 min.
  6. Die Serum-und Wunde supranate wird entfernt und in einem Standard-Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C.

Assay-Analyse

  1. Nachdem alle Proben gesammelt werden, werden sie aufgetaut und analysiert gleichzeitig.
  2. Zytokine sind dann unter Verwendung a17-Multiplex-Bead-Immunoassay Platte. Multiplex Immuno-Assay-Technik ermöglicht Testen von bis zu 100 Analyten in Körperflüssigkeiten Proben so klein im Volumen von 50 ul und Ergebnisse vergleichbar mit denen bei ELISA erhalten. Diese Platte ist in der Lage Interleukin 1ß (IL-1ß), Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 5 (IL-5), Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 7 (IL -7), Interleukin 8 (IL-8), Interleukin (IL-10), Interleukin 12 (IL-12), Interleukin 13 (IL-13), Interleukin 17 (IL-17), Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF) , Interferon α (INFα), Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Monozyten chemotaktische Protein 1 (MCP-1) und Makrophagen inflammatorisches Protein 1 (MIP-1β).
  3. Nerve growth factor ist mit NGF Antikörper DY256, indem Sie es der 17-plex-Platte mit Hilfe der Bio-Plex Amin-Kupplung-Kit gemessen.
  4. Jede Messung wird in Duplikate gefertigt und nach Angaben des Herstellers. Standard-Kurven für jeden Analyten werden mit dem Verweis Analyten von den Herstellern angegebenen Konzentrationen von 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml plus eine Null-Standard (normale Salzlösung nur) generiert. Standard-Kurven sind in jedem Durchlauf-und Probe-Konzentrationen wurden mit Bio-Plex Manager-Software berechnet.
  5. Prostaglandin E2 und Substanz P werden mit einem hoch Empfindlichkeit ELISA Kits Jeder Test in zweifacher Ausfertigung nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

    Abbildung 1
    Abbildung 1

    Abbildung 1: Exsudat und Serumspiegel von verschiedenen pro-und anti-inflammatorischen Zytokinen (Interleukin 1ß (IL-1ß), Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 5 (IL-5), Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 7 (IL-7), Interleukin 8 (IL-8), Interleukin (IL-10), Interleukin 12 (IL-12), Interleukin 13 (IL-13), Interleukin 17 (IL -17), Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF-α), Interferon γ (INFγ), Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Monozyten chemoattractant protein 1 (MCP-1 ) und Makrophagen inflammatorisches Protein 1 (MIP-1ß), nerve growth factor (NGF), Prostaglandin E2 (PG-E2) und Substanz P (SP)-Spiegel (pg / mL) zu Studienbeginn gemessen, 6 und 24 Stunden nach der Kaiserschnitt .

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Discussion

Die On-Q ® PainBuster ® Pain Relief-System sollte in der gesamten Einschnitt in subkutane Schicht eingefügt gerade vor dem Wundverschluss. Dies erleichtert die Aspiration über den Dreiwegehahn an der angegebenen Zeitintervallen. Die On-Q ®-System liefert kontinuierlich physiologische Kochsalzlösung subkutan in die Wunde mit einer Rate von 2 ml / h. Dies verhindert, dass der Katheter Blutgerinnung und verbessert die Zuverlässigkeit des Systems, um Exsudat Proben zu produzieren. Falls Aspiration von Exsudat ist schwer (ca. 5% der Fälle), in Erwägung ziehen, das Thema der Position (zB Sitz der Patient oder liegend zu flach), indem Sie sanft über die Wunde mit einem 0,5-1ml physiologischer Kochsalzlösung spülen oder Zurückziehen des Katheters 1-2 cm.

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Acknowledgements

Dr. Carvalho Arbeit wird von einem Gebäude Interdisziplinäre Karriere in der Frauenheilkunde Forschungsstipendium aus dem Office of Research auf Frauengesundheit und National Institute of Child Health and Human Development von den National Institutes of Health (5K12 HD043452) unterstützt. Dr. Angst erhielt liefert (die On-Q ® PainBuster ® Post-Op Pain Relief System) und die Finanzierung für die Durchführung der biochemischen Assays von I-Flow (Lake Forest, CA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

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References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
  2. Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

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