포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

Biology

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Summary

여기서 우리는 분리 방법 및 출생 후의 마우스 문화 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포와 소뇌 과립 신경을 제시.

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Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons . J. Vis. Exp. (23), e990, doi:10.3791/990 (2009).

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Abstract

소뇌 피질의 연결 속성과 개발 1,2를 공부에 대해 고유한 기회를 제공하는 잘 설명하는 구조입니다. 소뇌의 연결 유형 (과립 세포, Purkinje 세포와 억제 interneurons)의 과립 뉴런은 지금까지 가장 많은 있으며, 포유류의 두뇌에 신경 가장 풍부한 타입입니다. 설치류 동물에서 소뇌 과립 신경이 소뇌 피질, 외부 과립 층 (EGL)의 바깥쪽 레이어의 전구 세포에서 처음 두 포스트 나탈 주 동안 생성됩니다. 여기에 제시 프로토콜은 풍부 기술과 문화 과립 신경 및 사후 나탈 마우스 소뇌에서 자신의 전구 세포를 설명합니다. 우리는 과립 신경 5,6에 전구 세포를 proliferating의 차별을 연구하는 데 사용할 수있는 순수 증가 3,4의 문화를 구하는 절차를 설명합니다. 일단 전구 세포는 문화가 또한 synaptogenesis, 글루 탐 산염 수용체 기능 7, 기타 정화 소뇌 세포 8,9 또는 세포 사망 7 상호 작용과 같은 현상의 실험적 조작 및 특성에 대한 과립 뉴런의 동질적인 인구를 제공, 차별.

Protocol

1 부 : (동영상에 표시되지 않음) (1-2일 절개 전) 설정

  1. 문화 솔루션과 미디어 준비 :
    • 4X CMF - PBS - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Percoll의 dilutions을위한 칼슘, 마그네슘 자유 인산 버퍼 호수 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) : 당 리터, 32g NaCl, 1.2 g KCl, 8g 포도당, 2g 아니 2 PO 4 1g KH 2 PO를 추가 4, 8 ML 2% NaHCO 3 재고, deionized / 증류수 10 ML 1M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0). 1리터 및 7.4에 산도로 볼륨을 조정합니다. 소독 필터.
    • HBSS - 포도당 : 칼슘, 마그네슘 무료 행크의 밸런스 소금 솔루션 (HBSS) 및 살균 필터에 추가 포도당 (6g / 리터). 500 ML은 ° C 한달에 최대 4 저장할 수 있습니다.
    • 문화 미디어 : 혈청이없는 매체 (SFM)와 10 % FBS 배지. 48 ML하기 Neurobasal - 중간 500 μl 100X GlutaMAX I, 500 μl 100X의 페니실린 - 스트렙토 마이신 (최종 100 단위의 페니실린과 100 μg의 스트렙토 마이신), 6.25 μl 2 M KCl을 (250 μm의 최종) 추가합니다. 9 ML 2 aliquots 40 ML에 가라. 10% FBS 매체를 준비하려면, 9 ML의 나누어지는에 열 inactivated FBS의 1ml를 추가합니다. SFM를 준비하려면 40 ML의 나누어지는에 혈청이없는 보완 B - 27 800 μl를 추가합니다. 소독 필터 2 주 최대 4 ° C에 저장합니다. 각 실험에 대한 새로운 미디어를 만드는 최상의 결과하십시오.
  2. PERCOLL의 DILUTIONS 준비 :
    • Percoll은 액체로 공급되며 그것은 사용하기 전에 산성해야합니다. 산도 7.4에 도달할 때까지 주식을 준비하려면 1-2시간 기간 동안 Percoll 솔루션에 조금씩 1N HCL을 조금 추가합니다. 너무 빨리 HCL를 추가하면 집계에 Percoll의 원인이됩니다. 1N HCL 약 6.5ml은 Percoll의 각 리터 필요합니다. 소독 필터와 4 저장 ° C.
    • 35 %, 60 % (권 : 권) Percoll 희석은 Percoll 기울기 단계에서 사용됩니다. Percoll 주식의 35 또는 60 ML을 포함하는 100 ML Percoll의 dilutions 준비, 4X CMF - PBS - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 소주의 25 ML은 / 최종 볼륨 H2O deionized. 60 % 용액에 청색 toluidine 몇 방울을 추가, 그것은 인터페이스와 세포를 시각적으로 도움이 될 것입니다. 소독 필터와 4 저장 ° C.
    • 부적 절한 버퍼링이 절차를 수행하는 동안 증가 세포 사망의 원인이되므로 4X CMF - PBS - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)은, 3 개월 이상은 안됩니다.
  3. 준비 COVERSLIPS : 유리 coverslips는 (최고의 카롤 생물 공급 회사의 경우), 가벼운 교반과 함께 실온에서 하룻밤 10% HCL로 씻은 deonized / 증류수로 깨끗이 씻어서 70 % 에탄올에 저장되어 있습니다. 사용하기 전에 단일 coverslips은 불꽃 - 소독 짧게 에탄올 증발까지 오픈 화염 (알콜 램프)를 통해 포셉으로 그들을 개최하여. 12 mm 유리 coverslips는 6 잘 문화 접시에 4 잘 문화 접시와 25 mm coverslips에 삽입할 수 있습니다.
  4. 기판 코팅 문화 선박 : 그들이 쉽게 현미경으로 시각화를위한 유리 슬라이드에 장착할 수 있으므로 immunofluorescence 얼룩이나 약물 치료의 유리 coverslips에 대한 더 적합합니다. 세포의 큰 숫자는 단백질이나 RNA 샘플을 수집하기 위해 필요한 경우, 세포가 플라스틱 문화를 해부하기 전에 dishes.The 밤에 교양 수있는, 문화에 대한 유리 coverslips 또는 플라스틱 요리는 폴리 - D - 라이신 (500 μg / ML로 코팅되어야합니다; μl / 잘 6 - 잘 접시 800 또는 350 μl / 음 4 - 잘 접시를 위해). 5 MG / 폴리 - D - 라이신의 ML 주식 솔루션은 -20 ° C 후, 멸균 deonized / 증류수 및 사용하기 전에 멸균 필터링 오른쪽에서 희석에 저장됩니다. 문화 선박이 37 incubated 아르 ° C 숙박 (또는 적어도 도금 전에 2 시간 용)과 도금하기 전에 멸균 deonized / 증류수 오른쪽과 함께 두 번 세탁.
  5. PREPLATING 요리를 준비 :이 요리는 기판의 낮은 농도에 더 쉽게 준수 glial 오염 물질을 제거하는 문화 전에 격리 소뇌 세포를 미리가 도금에 사용됩니다. 폴리 - D - 라이신 (;이 culturing에 사용되는 농도의 1 / 5 주 100 μg / ML)의 그릇 당 4 ML과 문장이 60 mm 플라스틱 문화 요리. 37 품어 ° C 숙박 (또는 적어도 해부하기 전에 2 시간 용). 오른쪽 절개 전에, 폴리 - D - 라이신 솔루션을 제거하는 살균 물로 두 번 설거지를하고 후드의 건조 수 있습니다.
  6. 압력솥이나 해부 당일 해부 도구를 소독, 20 분 70 %의 에탄올에있는 도구를 잠그다. 필요한 도구 : Permaset 가위, microdissecting 가위, 넷 더몬트 # 5 해부 포셉.

2 부 : 절개 (절개의 날)을위한 준비 - (동영상 시연)

언급하지 않는 한 다음 절차의 모든 조직 문화 후드에서 수행됩니다.

  1. 70 % 에탄올로 해부 영역을 아래로 닦아주십시오. ° C 물 목욕이나 5 % CO 2 37 ° C 배양기에서 37로 미디어를 따뜻하게.
  2. 새로운 Papain 분리 시스템 키트 (워싱턴)를 시작할 때, 알부민 - ovomucoid 억제제의 솔루션을 준비합니다. 32 ML 추가EBSS (얼의 밸런스드 소금 솔루션, 키트에 제공)의 알부민 - ovomucoid 억제제 혼합물과 다른 구성 요소를 준비하는 동안 내용이 용해 수 있습니다. 처음 사용 Reconstitute, 그때 2-8에서 남아있는 솔루션을 저장 ° C 각 키트에 의해 허용되는 다섯 isolations이 완료될 때까지 사용합니다. 것은
  3. 분리 키트 (각 유리병은 출생 후의 5 일 마우스 4-15 cerebella의 분리에 충분합니다) 한 papain의 약병에 EBSS 5 ML을 추가합니다. 5 % CO 2 37 papain 병을 플레이스 ° C 배양기 또는 37 ° papain 완전히 해산 및 솔루션 분명히 나타날 때까지 5~10분위한 C 물 목욕. 해부 동안 상온에서 솔루션을 유지합니다.
  4. 분리 키트에서 하나의 약병에 DNase EBSS 500 μl를 추가합니다. DNase는 전단 변성에 민감 있기 때문에 병을 감청하여 부드럽게 섞는다. papain (최종 농도가 20 단위 / ML의 papain과 0.005 % DNase입니다)이있는 유리병에이 솔루션을 250 μl를 추가합니다. 5.1 또는 6.1 단계에서 사용하기 위해 나머지 DNase의 약병을 저장합니다.

파트 3 : 해부 및 Meninges 제거

  1. C57BL/6J 마우스의 과립 세포 배양을위한 최적의 연령은 출생 후의 일 4-6 EGL peaks1, 10 과립 세포 progenitors의 수입니다. 것입니다 새끼 한 번에 하나씩 해부하다하고 소뇌 해부 더욱 친숙해질 같은 새끼 당 더 이상 6보다 분 해부 시간을 줄이기 위해 시도합니다. 속도는 본질입니다.
    Percoll 기울기 단계가 무시하는 경우, 여덟 출생 후의 일 5 마우스 새끼 한 6 자 문화 플레이트 (여섯 25 mm coverslips)에 대한 여섯 4 잘 문화 플레이트 (또는 스물넷 12 충분한 세포를 얻을 수 있습니다 - mm의 coverslips). 대략 수율은 강아지와 도금 밀도 당 4 5x106 세포 cells/cm2 1 ~ 5X105을 범위를 수있다는 것입니다. 15~20% 세포가 Percoll step4 중에 손실되기 때문에, 더 많은 동물이 동일한 원하는 세포 밀도를 얻기 위해 필요합니다.
  2. 피펫 살균 팰컨 15 ML 원뿔형 플라스틱 튜브에 60 mm 플라스틱 조직 문화 요리 및 10 ML에 HBSS - 포도당 15 ML. 얼음 입어.
  3. 후드 이외의 70 % 에탄올로 강아지의 머리를 닦아냅니다. 강아지 목을 벨로 Permaset 가위를 사용합니다. (잘린는 동영상에 표시되지 않습니다.)
  4. 당신은 명확하게 두개골의 뒷면을 볼 수 있도록 후드에서 더몬트 집게로 머리를 잡아. 구멍의 매그넘에 microdissecting 가위를 삽입하고 눈을 향해 직선 절단하여 두뇌에 액세스할 수 있습니다. 피부 껍질, 집게를 사용하여 두뇌를 노출하기 위해 두개골을 올려요. 더몬트 집게를 사용하여 소뇌 및 주변 midbrain을 꼬집어하고 HBSS - 포도당과 함께 접시에 전송할 수 있습니다. (그것은 소뇌가 여전히 주변 조직에 연결된 경우 소뇌을 조작하고 meninges를 제​​거하는 것이 더 쉽습니다.)
  5. 해부 현미경, 부드럽게 소뇌에서 meninges 껍질 또한 접시에 소뇌를 앵커로 다른 집게를 사용하는 동안 한 멋진 더몬트 # 5 포셉있는 엽 (叶) 사이. 당신은 소뇌의 표면에 혈관을 통지합니다. 이러한 혈관은 meninges을 식별하는 좋은 방법입니다. 소뇌가 헝클어진 흰 ​​모양에 소요 때까지 meninges를 제​​거합니다. midbrain의 나머지 부분에서 소뇌를 구분한다. 는 복부쪽으로 그것을 켜고 복부 소뇌와 인접한 midbrain 사이에 붉은 리본처럼 보이는 맥락막 얼기를 제거합니다. 빨리 해부로 얼음에 15 ML 원뿔 관에 HBSS - 포도당 추운 각 소뇌를 배치합니다. 3 머리를 해부 후 HBSS - 포도당 신선한에 해부 솔루션을 변경합니다.

4 부 : 세포 현탁액

  1. 일단 모든 해부 작업이 완료, 튜브의 HBSS - 포도당을 제거하고 단계 2.4 만든 papain 솔루션으로 대체합니다. 키트 작은 조각의 조직을 절단하는 것이 좋습니다 있지만, 우리는이 나이에 cerebella를 잘라내거나 말하다 필요가 없습니다 것을 발견했습니다. 37 조직 + papain 솔루션 (15 ML 원뿔 튜브) 장소 ° C 물 목욕이나 5% CO 2 37 15~20분에 대한 ° C 배양기. 4-8 cerebella, 37에서 15 분 동안 ° C가 충분합니다; cerebella의 큰 숫자에 대해 20 ~ 30 분 더 있습니다. 부드럽게 관에게 매 3 4 분 선동.
  2. FBS로 코팅되어 살균 P1000 에어로졸의 피펫 팁로 혼합물을 씹다. 모든 공기 방울 형성​​을 방지하기 위해이 단계를 부드럽게 마십시오. 소방 광택 유리 pipettes를 사용하지만, 우리는 혈청 살균 코팅 P1000 에어로졸 도움말 단지뿐만 아니라 작동하는지 찾을 수 있습니다. 코트 FBS와 피펫 팁하려면, 피펫 FBS 위아래 두 번 그냥 사용하기 전에. 피펫와 약 10 아래로 움직임이 조직을 떼어 놓다 충분히 있습니다. 이 솔루션은 뿌연 될 것입니다. 정지가 undissociated 조직의 큰 조각은 튜브의 바닥에 해결할 수 있도록 30-60초 위해 앉아 수 있습니다.
  3. 정지 세포 (주의 B에서 undissociated 조직 조각을 제거하지 제거혈청 코팅 피펫 팁을 가진 신선한 15 ML 원뿔 관에 ottom). 상온에서 5 분 정도 200xg에서 원심 분리기. 다시 서스펜션 매체를 준비합니다. 이렇게하려면, 멸균 튜브에 재구성 알부민 - ovomucoid 억제제 솔루션 300 μl와 2.7 ML EBSS를 섞는다. 2.4 단계에서 DNase 솔루션 150 μl를 추가합니다.
  4. centrifuging 후, 표면에 뜨는를 버리고 즉시 희석 DNase / 혈청 코팅 P1000 에어로졸 피펫 팁과 단계 4.3에서 준비 알부민 억제제 솔루션 세포 펠렛을 resuspend.
  5. 다음과 같이 불연속 밀도 기울기를 준비합니다. 15 ML 원뿔 관에 알부민 - ovomucoid 억제제 솔루션의 5 ML을 추가합니다. 위에 조심스럽게 레이어 세포 현탁액. 상온에서 6 분 정도 70xg에서 원심 분리기. 튜브 하단의 Dissociated 세포 펠렛은 멤브레인 조각 인터페이스에 남아 있습니다.
  6. 이 과립 세포에 농축 아르 문화를 얻는하고자하는 경우, Percoll 기울기 분리 단계 (소뇌 과립 세포의 순수한 문화를 산출하는) 무시하고, 6 부로 진행합니다. 당신이 더 Percoll 기울기 분리에 의해 glia 대형 interneurons에서 과립 세포를 분리하려는 경우 제 5 부로 진행합니다. Percoll 기울기 단계의 사용은 세포의 수율을 줄일 수 있습니다. 우리 손에, 이윤율의 감소는 약 20-35%입니다. 그러나, 약 90% 95-99의 %로 과립 신경 및 전구 세포의 농축 증가가있다.

제 5 부 : Percoll 기울기 분리

  1. 뜨는을 취소하고 즉시 단계 2.4에서 DNase 50 μl와 HBSS - 포도당 2 ML에서 펠렛을 resuspend. 중력에 의한 나일론 메쉬 (기공 크기가 70 μm의) 비록 세포 현탁액을 필터링합니다. 이 단계는 큰 비의 연결 세포를 제거하고 더 나은 단일 세포 현탁액을 위해 제공하는 것입니다.
  2. 이 화재 - 광택 유리 파스퇴르 pipettes 준비. 이렇게하려면 부드럽게 불꽃은 가장자리가 smoothened 및 피펫 구멍 때까지 유리 피펫의 끝에 원래 크기의 40~50%입니다. 자리가 너무 작게 만들 안됩니다.
  3. Percoll 기울기를 준비합니다. 50 ML 살균 원뿔 관에 35 % Percoll 솔루션의 장소 10 ML. 60% Percoll (10 ML)은 첨부 살균 척추 바늘로 10 ML 멸균 주사기에로드됩니다. 척추 바늘과 튜브의 하단에있는 60 %의 솔루션을 추가하여 35 % 용액 아래 부드럽게 계층 60 % Percoll 솔루션. 날카로운 인터페이스 두 레이어 사이에 유지하는데주의를 기울여야. 부드럽게 인터페이스를 방해하지 않고 튜브의 측면을 따라 그들을 추가, 불타는 광택 피펫을 사용하여 그라디언트의 상단에 셀을 추가합니다.
  4. 1800xg에서 원심과 원심의 튜브를 조심스럽게 넣습니다. 그것이 원하는 속도에 도달하는 약 2 분 정도 소요되도록 : 속도가 한 단계마다 20 초 (약 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg 속도의 증가는 다음과 같다)까지 램프. 1800xg에 도달하기 위해 10 분 타이머를 시작합니다. 완료되면, 점차 한 단계마다 20 초 속도 감소.
  5. 그라디언트의 상위 인터페이스 (대형 glia, Purkinje 세포와 interneurons를 포함)의 제거 및 폐기.
  6. 신중하게 불을 광택 피펫과 50 ML 원뿔 튜브로 전송으로 35 %, 60 % Percoll 사이의 인터페이스에있는 세포를 제거합니다. HBSS - 포도당과 반전 몇 배 혼합 3 권 Resuspend. 1100xg에서 5 분 동안 원심 분리기.
  7. 뜨는를 제거하고 DNase 50 μl와 10% FBS 배지 4 ML를 추가합니다. 부드럽게 단일 세포 현탁액을 형성하기 위해 불을 광택 피펫을 사용하여 펠렛을 Resuspend. 6.2 단계로 진행합니다.

6 부 : 사전 도금 및 도금

  1. 뜨는을 취소하고 즉시 단계 2.4에서 DNase 50 μl와 10% FBS 배지 4 ML에서 펠렛을 resuspend. 중력에 의한 나일론 메쉬 (기공 크기가 70 μm의) 비록 세포 현탁액을 필터링합니다. 이 단계는 큰 비의 연결 세포를 제거하고 더 나은 단일 세포 현탁액을 위해 제공하는 것입니다.
  2. 플레이트 5 % CO 2 37 ° C 배양기에서 20 분 동안 폴리 - D - 라이신 코팅 미리 도금 요리에 수집된 세포. 신선한 요리와 함께 반복합니다. astroglia과 무거운 세포가 진정하고 요리를 준수하고 작은 과립 뉴런과 신경 세포의 전구 세포가 떠있는 떠날 것이다. 부화 후, 느슨하게 붙어 과립 뉴런과 신경 세포의 전구 세포가 쉽게 dislodged되고 접시의 부드러운 도청과 느슨하게.
  3. 5 분 200xg에서 15 ML 원뿔 관과 원심 분리기의 과립 뉴런과 신경 세포의 전구 세포를 수집합니다. 혈청이없는 배지 1 ML에서 펠렛을 Resuspend과 hemocytometer를 사용하여 10 μl의 나누어지는를 계산합니다.
  4. 원하는 세포 밀도에 도달하는 혈청이없는 매체를 추가합니다. 중간 밀도에 대한 판에 세포의 숫자가 대략적인 지침 : 6 - 그럼 접시, 3.5-4000000 전지, 4 자 번호판, 650,000 전지. 6 - 잘 문화 접시 들면, 플레이트 1.5 ML / 음과 4 잘 괞찮아드디어, 내가 플레이트 0.5 ML / 음. 세포는 5 % CO 2 37 ° C 배양기에서 유지됩니다. 후속 변경 사항을 모든 2-3일 24 시간 후에 완전히 매체를 변경합니다.

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Discussion

이 프로토콜은 과거 3,7,11에서 설명했습니다 절차의 변경에 따라 달라집니다. 아래의 논의로 참고하기 위해 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다.

과립 신경 및 전구 세포는 도금 2 시간 이내에 준수. 건강한 세포의 위상 대비 현미경 4 아래 둥근 형태 있습니다. 도금 후 24 시간 이내에, 건강한 세포는 coverslips 또는 플라스틱 잘 주위에 균일하게 확산하고, 프로세스를 형성합니다. 최초의 매체 변화의 시간에 24 시간 후, 몇 죽은 세포 부동있을 것입니다. 몇 세포 분리 과정에서 죽게하거나 건강에 해로운가 될로서 이것은 정상입니다. 48 시간 후 세포가 자신의 프로세스에 varicosities 함께 clumped있다면 그러나, 세포는 건강에 해롭습거나 폴리 - D - 라이신 기판은 독성도. 대부분의 기판과 마찬가지로, 폴리 - D - 라이신의 효능은 많이 의존하고 있으며 각각의 새로운 많은 테스트해야합니다. 건강한 문화의 이미지를 참조 4,11, 20에서 찾을 수 있습니다. 건강한 세포까지 이주 8을위한 문화의 유지하실 수 있습니다.

과립 신경 세포의 progenitors은 도금 8,12,13,14에 따라 차별화 시작합니다. 최적의 도금 밀도가 연구를 위해 설립되면 증식이 같은 노치 신호 15 요인에 의해 추진되며, 세포가 높은 밀도에서 자세한 내용을 분아 따위에 의해 번식하기 때문에, 그것은, 유지하여야한다. 과립 신경 세포의 progenitors의 확산은 크게 매체 12,13,14에 소닉 헤지 호그 (쉬)를 추가하여 연장하실 수 있습니다. Laminin은 또한 neurite의 파생물 16,17을 추진 폴리 - D - 라이신 이외에 기판으로 추가할 수 있습니다. 과립 세포 배양의 이러한 기능은 과립 뉴런의 생물학이나 신경 6,18,19에 progenitors 세포의 분화의 규정 중 하나를 연구하는 시스템을 제공합니다.

출생 후의 생쥐에서 분리된 소뇌 세포는 처음에는 세포주기 8 다른 단계에 과립 뉴런과 신경 세포의 과립 progenitors의 혼합물로 구성되어 있습니다. 이 astroglia들도 있고 interneurons는 격리 / 문화와 과립 뉴런과 과립 progenitors (95% -99 %)의 추가로 정화가 Percoll 기울기 분리 사에 의해 달성됩니다에 존재. Percoll 기울기 분리 단계를 사용하지 않고 얻은 농축 과립 세포가 증식하여 과립 신경 세포의 progenitors, 18,19,20의 분화의 규정을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 확증에서 우리가 Percoll 기울기 분리 단계는 쉬 이외없이 며칠 동안 세포주기의 나머지로 쉬 견고하게 대응하고 우회하여 고립된 인구에서 세포를 발견, 표시 등 문화의 거의 증식이 있습니다 세포 증식 메이커, Ki67과 염색법에 의해. 문화가 체외에서 며칠 이상 사용할 수있다면 그러나, 그것은 Percoll 기울기 단계가 아닌의 연결 세포를 proliferating하여 과립 뉴런의 오염을 감소 포함하는 것이 좋습니다.

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Acknowledgments

우리는 소중한 제안 바바라 Carletti과 안나 마리 케니 감사합니다. , DK07328 : HYL는 교육 부여 "생화학 및 분자 생물학 호르몬"에 의해 지원됩니다. NIH 교부금 5R01 NS16951 (CAM)에 의해 부분적으로 지원.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore BD Biosciences 352350
Spinal Needle BD Biosciences 405182 20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000 Sigma-Aldrich P1024 Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll Sigma-Aldrich P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X) Sigma-Aldrich P4333
HBSS Invitrogen 14175-103 Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium Invitrogen 10888-022
Glutamax I supplement Invitrogen 35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
12-mm circle coverslips Carolina Biological 63-3029 These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips Carolina Biological 63-3037 These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System Worthington Biochemical LK 003150 Kit is good for five isolations.
Permaset scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS6782
Dumont #5 (Dumostar) Roboz Surgical Instruments Co. RS4978
4-well culture dish Nalge Nunc international 176740
6-well culture dish Nalge Nunc international 140685

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References

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  20. Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. Development. 128, 1481-1481 (2001).

Comments

1 Comment

  1. very good  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 19, 2009 - 4:59 AM

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