בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מציגים שיטה לבודד cerebellar תרבות גרגר עצב ובתאים ונוירונים גרגיר cerebellar מהעכבר לאחר הלידה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons . J. Vis. Exp. (23), e990, doi:10.3791/990 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

קליפת המוח הקטן הוא מבנה תיאר היטב המספק הזדמנויות ייחודיות ללימוד המאפיינים עצב 1,2 פיתוח. סוגי נוירונים המוח הקטן (תאים גרגיר, תאים פורקינג' ו interneurons מעכבות), גרגיר נוירונים הם ללא ספק רבים ביותר הן הסוג הנפוץ ביותר של הנוירונים במוח היונקים. במכרסמים, הנוירונים גרגיר cerebellar נוצרות במהלך שני הראשונים שלאחר הלידה שבועות ובתאים בשכבה החיצונית של קליפת המוח הקטן, את השכבה החיצונית גרגיר (EGL). הפרוטוקול המובא כאן מתאר טכניקות להעשיר גרגיר נוירונים תרבות ובתאים שלהם המוח הקטן שלאחר הלידה העכבר. נתאר הליכים כדי להשיג תרבויות של טוהר הגדלת 3,4, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את הבידול של מתרבים ובתאים לתוך הנוירונים גרגיר 5,6. לאחר ובתאים להבדיל, התרבויות גם לספק אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים גרגיר מניפולציה אפיון ניסיוני של תופעות כגון synaptogenesis, פונקציה קולטן הגלוטמט 7, אינטראקציה עם תאים אחרים cerebellar מטוהרים 8,9 או מוות של תאים 7.

Protocol

חלק 1: הגדרת (1-2 ימים לפני הניתוח) (לא מוצג וידאו)

  1. הכנת פתרונות תרבות MEDIA:
    • 4X-CMF PBS-EDTA (סידן ומגנזיום חופשי פוספט שנאגרו מלוחים EDTA עבור דילולים Percoll): ליטר, להוסיף 32 גרם NaCl, 1.2 גרם KCl, 8 גרם גלוקוז, 2 גרם לאא 2 PO 4, 1 גרם KH 2 PO 4, 8 מ"ל 2% מניות NaHCO 3, 10 מ"ל 1M EDTA (pH 8.0) כדי מים מזוקקים / deionized. התאם את נפח 1 ליטר ו pH 7.4 ל. סנן לעקר.
    • HBSS-גלוקוז: גלוקוז הוסף (6 גרם / ליטר) ל סידן ומגנזיום מלח מאזן חינם של האנק פתרון (HBSS) ולסנן סטרילית. 500 מ"ל ניתן לאחסן 4 ° C עד חודש.
    • תרבות MEDIA: סרום ללא בינוני (SFM) ו 10% בינוני FBS. עד 48 מ"ל של Neurobasal A-בינונית להוסיף 500 μl 100x GlutaMAX אני, 500 100x μl פניצילין, סטרפטומיצין (סופי 100 יחידות פניצילין סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם), 6.25 μl 2 M KCl (סופי 250 מיקרומטר). פיצול של 2 מ"ל aliquots של 9 ו 40 מ"ל. כדי להכין 10% FBS בינוני, מוסיפים 1ml של חום מומת FBS ל aliquot 9 מ"ל. כדי להכין SFM, להוסיף 800 μl של סרום ללא תוספת B-27 aliquot 40 מ"ל. סנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר 2 שבועות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להפוך את התקשורת טריים עבור כל ניסוי.
  2. הכנות דילולים PERCOLL:
    • Percoll מסופק כנוזל והוא חייב להיות acidified לפני השימוש. כדי להכין את המניות, מוסיפים HCl 1N לאט לאט לפתרון Percoll במשך 1-2 שעות, עד pH 7.4 הוא הגיע. הוספת HCl מהר מדי תגרום Percoll לצבור. 6.5ml של כ HCl 1N יש צורך ליטר אחד Percoll. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C.
    • 35% לבין 60% (כרך: כרך א) דילול Percoll ישמשו בשלב שיפוע Percoll. הכן 100 מ"ל דילולים Percoll המכיל 35 או 60 מ"ל של Percoll המניות, 25 מ"ל של 4X-CMF PBS-EDTA ו מזוקקים deionized / H2O לנפח הסופי. הוסף כמה טיפות של toluidine כחול לפתרון 60%, זה יעזור להמחיש את הממשק התאים. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C.
    • 4X-CMF PBS-EDTA לא צריך להיות מעל גיל 3 חודשים, כפי חציצה מספקת תגרום מוות של תאים מוגברת במהלך ההליך.
  3. COVERSLIPS הכנות: coverslips זכוכית (הכי טוב אם מהחברה אספקה ​​קרוליינה ביולוגית) נשטפים עם HCl 10% למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה קלה, שטופים היטב במים מזוקקים / deonized ומאוחסנים אתנול 70%. לפני השימוש, coverslips יחיד להבה מעוקרים בקצרה על ידי מחזיק אותם עם מלקחיים מעל להבה פתוחה (מבער בונזן) עד מתאדה אתנול. 12 מ"מ coverslips זכוכית ניתן להציב 4-גם צלחות תרבות 25 מ"מ coverslips ב 6 צלחות גם תרבות.
  4. תרבות ציפוי כלי שייט עם המצע: עבור מכתים immunofluorescence או טיפולים תרופתיים coverslips זכוכית מתאימים יותר כיוון שהם יכולים להיות מותקן בקלות להדמיה תחת מיקרוסקופ על שקופיות הזכוכית. כאשר מספר גדול של תאים נדרשים לאיסוף דגימות חלבון או RNA, תאים יכול להיות מתורבת על תרבות הפלסטיק לילה dishes.The לפני לנתיחה, coverslips זכוכית או כלי פלסטיק לתרבות חייב להיות מצופה פולי-D-ליזין (500 מיקרוגרם / מ"ל; 800 μl / היטב היטב 6 צלחות או 350 μl / גם עבור 4-גם הצלחות). 5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות של פולי-D-ליזין מאוחסן ב -20 ° C, ואז מדולל במים מזוקקים / deonized סטרילית הזכות סינון סטרילי לפני השימוש. כלי התרבות מודגרת על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (או לפחות למשך 2 שעות לפני ציפוי) ורחץ פעמיים עם ימין מזוקקים / מים סטריליים deonized לפני ציפוי.
  5. הכנת מנות PREPLATING: אלו מאכלים ישמש מראש ציפוי לתאי המוח הקטן מבודד לפני התרבות להסרת מזהמים גליה, אשר דבקים יותר בקלות ריכוז נמוך יותר של המצע. Two Coat 60 מ"מ פלסטיק תרבות מנות עם 4 מ"ל לכל צלחת של פולי-D-ליזין (100 מיקרוגרם / מ"ל; הערה זו היא 1 / 5 של ריכוז המשמש culturing). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (או לפחות 2 שעות לפני דיסקציה). ממש לפני הניתוח, הסר את הפתרון poly-D-ליזין, לשטוף כלים פעמיים עם מים סטריליים ולאפשר לייבוש למכסה המנוע.
  6. לעקר כלי לנתיחה ב החיטוי או ביום לנתיחה, לטבול את הכלים באתנול 70% במשך 20 דקות. הכלים הדרושים: מספריים Permaset, מספריים microdissecting, ארבעה דומון # 5 מלקחיים לנתח.

חלק 2: הכנת Dissection (יום דיסקציה) - (הפגינו וידאו)

כל הנהלים הבאים מבוצעות ברדס בתרבית רקמה אלא אם צוין.

  1. נגבו את אזור לנתח עם אתנול 70%. חם התקשורת כדי 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או של 5% CO 2 37 ° C חממה.
  2. כאשר מתחיל חדש Papain דיסוציאציה מערכת Kit (וורטינגטון), להכין את הפתרון של מעכב אלבומין-ovomucoid. הוסף 32 מ"לשל EBSS (תמיסת מלח מאוזן של ארל, המסופק בערכה) לתערובת אלבומין-ovomucoid המעכב ולאפשר תוכן לפזר בעת הכנת שאר הרכיבים. מחדש לשימוש תחילה, ואחר כך לאחסן את הפתרון הנותרים ב 2-8 מעלות ושימוש עד חמש isolations המותר על פי הערכה בכל הושלמו.
  3. הוסף 5 מ"ל של EBSS אל הבקבוקון one papain מן קיט דיסוציאציה (כל בקבוקון מספיק עבור ניתוק של cerebella 4-15 מתוך 5 עכברים יום לאחר הלידה). מניחים את הבקבוקון papain ב 5% CO 2 37 ° C חממה או 37 ° C אמבט מים במשך 5 עד 10 דקות עד papain נמס לגמרי הפתרון נראה ברור. שמור את הפתרון בטמפרטורת החדר במהלך לנתיחה.
  4. הוסף 500 μl של EBSS כדי DNase בקבוקון אחד מתוך ערכת דיסוציאציה. מערבבים בעדינות על ידי הקשה על בקבוקון מאז DNase רגיש denaturation גזירה. הוסף 250 μl של פתרון זה בקבוקון המכיל את papain (הריכוז הסופי הוא 20 יחידות / מ"ל ​​ו papain DNase 0.005%). שמור את הבקבוקון הנותרים DNase לשימוש צעד 5.1 או 6.1.

חלק 3: Dissection ואת הסרת קרומי המוח

  1. הגיל האופטימלי עבור תרבית תאים גרגר מעכברים C57BL/6J הוא יום הלידה 4-6, כאשר מספר אבות תא גרגיר של EGL peaks1, 10. לנתח גורים אחד בכל פעם, וככל שאתה להכיר טוב יותר את לנתיחה cerebellar לנסות להפחית את זמן דיסקציה ללא יותר מ 6 דקות לכל גור. מהירות היא מהות.
    אם הצעד שיפוע Percoll הוא עקף, שמונה ימים לאחר הלידה-5 גורים העכבר יכול להניב מספיק תאים עבור צלחת 6-גם תרבות אחת (או שש coverslips 25 מ"מ) או במשך שש 4 צלחות גם התרבות (או 24 12 - מ"מ coverslips). תשואה משוער 4 עד 5x106 תאים לכל צפיפויות הגור ואת ציפוי יכול לנוע בין 1 ל 5X105 cells/cm2. מכיוון שתאי% 15-20 אבדו במהלך step4 Percoll, חיות נוספים נדרשים כדי להשיג את אותה צפיפות התא הרצוי.
  2. פיפטה 15 מ"ל של גלוקוז HBSS לתוך צלחת 60 מ"מ תרבות פלסטיק רקמות 10 מ"ל לתוך צינור סטרילי פלקון 15 מ"ל חרוטי פלסטיק. שימי על הקרח.
  3. מחוץ למכסה המנוע, לנגב את ראשו של הגור עם אתנול 70%. השתמש במספריים Permaset לערוף את הגור. (עריפת ראש ולא יוצג בסרטון).
  4. ב למכסה המנוע, להחזיק את הראש עם מלקחיים דומון, כך שאתה יכול לראות בבירור את החלק האחורי של הגולגולת. גש המוח על ידי החדרת מספריים microdissecting אל מגנום foramen חיתוך ישר לכיוון העיניים. בעזרת מלקחיים, לקלף את העור ולהרים את הגולגולת כדי לחשוף את המוח. בעזרת מלקחיים דומון, קמצוץ את המוח הקטן ואת המוח התיכון המקיף ולהעביר אותו בצלחת עם גלוקוז HBSS. (קל יותר לתמרן את המוח הקטן ולהסיר את קרומי המוח אם המוח הקטן הוא עדיין מחובר הרקמה הסובבת).
  5. תחת המיקרוסקופ לנתח, בעדינות לקלף את קרומי המוח את המוח הקטן וגם בין האונות עם אחד בסדר דומון # 5 מלקחיים תוך שימוש מלקחיים אחרות לעגן את המוח הקטן לצלחת. שימו לב וכלי הדם על פני השטח של המוח הקטן. כלי דם אלה הן דרך טובה לזהות את קרומי המוח. הסר את קרומי המוח עד המוח הקטן מקבל את המראה לבן סבוך. הפרד את המוח הקטן משאר המוח התיכון. הפעל את זה בצד הגחון שלה להסיר את מקלעת דמית העין, שנראה כמו סרט אדמדם בין המוח הקטן הגחון ועל המוח התיכון הסמוך. המקום כל המוח הקטן בקור HBSS הגלוקוז בצינור חרוטי 15 מ"ל על הקרח בהקדם גזור כמו. שנה את הפתרון כדי לנתח טרי HBSS הגלוקוז לאחר ביתור 3 מוחות.

חלק 4: השעיה Cell

  1. לאחר כל והניתוחים שתסיים, הסר את HBSS הגלוקוז מן הצינור ולהחליף אותו הפתרון papain עשה צעד 2.4. למרות הערכה ממליצה חיתוך הרקמה לחתיכות קטנות, אנו מוצאים כי אין צורך לחתוך או לקצץ cerebella בגיל זה. + מניחים את רקמת papain פתרון (בתוך שפופרת 15 מ"ל חרוטית) ב 37 ° C אמבט מים או 5% CO 2 37 ° C חממה 15 עד 20 דקות. במשך 4-8 cerebella, 15 דקות 37 ° C מספיק, עבור מספר גדול יותר של cerebella 20 עד 30 דקות הוא טוב יותר. בעדינות להתסיס את הצינור כל 3 עד 4 דקות.
  2. Triturate את התערובת עם טיפ סטרילי אירוסול p1000 פיפטה כי כבר מצופה FBS. האם הצעד הזה בעדינות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. מלוטש אש pipettes זכוכית ניתן להשתמש, אך אנו מוצאים כי הסרום מצופה סטרילי p1000 טיפים אירוסול לעבוד באותה מידה. כדי לצפות את קצה פיפטה עם FBS, פיפטה FBS למעלה ולמטה רק פעמיים לפני השימוש. כ -10 מעלה ומטה בתנועות עם פיפטה הם מספיק כדי לנתק את הרקמה. הפתרון יהיה מעונן. אפשר ההשעיה לשבת 30-60 שניות, כך שכל פיסות גדולות של רקמה undissociated יהיה ליישב לתחתית של התחתית.
  3. הסרת תאים מושעה (להיזהר שלא להסיר את פיסות הרקמה undissociated ב bottom) לתוך צינור חרוטי טרי 15 מ"ל עם קצה פיפטה בסרום מצופה. צנטריפוגה בכ 200xg במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הכן מחדש את ההשעיה בינוני. כדי לעשות זאת, לערבב עם 2.7 EBSS μl 300 מ"ל של תמיסת אלבומין-ovomucoid מחדש מעכב בשפופרת סטרילית. הוסף 150 μl של פתרון DNase משלב 2.4.
  4. לאחר centrifuging, לבטל את supernatant ומיד resuspend התא גלולה ב DNase בדילול / פתרון מעכב אלבומין מוכן בשלב 4.3 עם סרום מצופה p1000 אירוסול פיפטה קצה.
  5. הכן שיפוע צפיפות רציפה כדלקמן. הוסף 5 מ"ל של תמיסת אלבומין-ovomucoid מעכב צינור חרוטי 15 מ"ל. בזהירות התא השעיה על גבי שכבה. צנטריפוגה בכ 70xg במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר. תאים ניתק גלולה בחלק התחתון של הצינור, שברי קרום להישאר על הממשק.
  6. אם ברצונך לקבל תרבויות מועשרים בתאי גרגיר, לעקוף את ההפרדה שיפוע Percoll צעד (אשר מניב תרבויות טהור של תאים גרגר cerebellar), והמשך חלק 6. אם ברצונך להמשיך לבודד את התאים גרגיר של גליה ו interneurons גדול על ידי הפרדת צבע Percoll, המשך חלק 5. השימוש לשלב שיפוע Percoll תפחית את התשואה של תאים. בידיים שלנו, הפחתת התשואה היא כ 20-35%. עם זאת, קיימת עלייה העשרה של נוירונים גרגיר ו ובתאים של כ% 90 ל% 95-99.

חלק 5: ההפרדה Percoll Gradient

  1. בטל supernatant ומיד resuspend גלולה ב 2 מ"ל של גלוקוז HBSS עם 50 μl של DNase משלב 2.4. סנן את ההשעיה התא אף רשת ניילון (גודל הנקבוביות 70 מיקרומטר) על ידי כוח הכבידה. פעולה זו תסיר גדולים שאינם נוירונים בתאי ומספק להשעיה טוב תא בודד.
  2. להכין שתי אש זכוכית מלוטשת pipettes פסטר. כדי לעשות זאת, בעדינות את קצה הלהבה פיפטה כוס עד קצה הוא והחלקתי את לשעמם פיפטה הוא 40-50% בגודל המקורי. הקפד לא לבצע פתיחת קטן מדי.
  3. הכן שיפוע Percoll. מקום 10 מ"ל של תמיסת Percoll 35% בתוך שפופרת 50 מ"ל חרוטי סטרילית. 60% Percoll (10 מ"ל) הוא נטען לתוך מזרק סטרילי 10 מ"ל עם מחט סטרילית השדרה המצורפת. בעדינות את השכבה 60% Percoll פתרון מתחת הפתרון 35%, על ידי הוספת הפתרון 60% בחלק התחתון של הצינור עם מחט השדרה. תשמרי על עצמך כדי לשמור על ממשק חדה בין שתי שכבות. הוסף את התאים לחלק העליון של שיפוע בעזרת פיפטה אש מלוטש, בעדינות להוסיף אותם בצד של הצינור מבלי להפריע את הממשק.
  4. בזהירות במקום צינור בצנטריפוגה ו צנטריפוגות ב 1800xg. כבש את מהירות צעד אחד כל 20 שניות (בהפרשים של מהירות הן כדלקמן: כ 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg), כך שזה לוקח כ 2 דקות כדי להגיע למהירות הרצויה. הפעל את שעון העצר על 10 דקות כאשר 1800xg הוא הגיע. בסיום, להקטין מהירות בהדרגה צעד אחד כל 20 שניות.
  5. הסר את ממשק העליון של השיפוע (המכיל גליה גדול, תאים פורקינג' ו interneurons) וזורקים.
  6. בזהירות להסיר את התאים בממשק שבין 35% לבין 60% Percoll עם פיפטה אש מלוטש ולהעביר צינור חרוטי 50 מ"ל. Resuspend ב 3 כרכים של גלוקוז HBSS ומערבבים מספר פעמים על ידי היפוך. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1100xg.
  7. הסר את supernatant ולהוסיף 4 מ"ל של מדיום FBS 10% עם 50 μl של DNase. Resuspend את הכדור בעדינות בעזרת פיפטה אש מלוטש כדי ליצור השעיה תא בודד. המשיכו לשלב 6.2.

חלק 6: טרום ציפוי ציפוי

  1. בטל supernatant ומיד resuspend את הכדור בתוך 4 מ"ל של מדיום FBS 10% עם 50 μl של DNase משלב 2.4. סנן את ההשעיה התא אף רשת ניילון (גודל הנקבוביות 70 מיקרומטר) על ידי כוח הכבידה. פעולה זו תסיר גדולים שאינם נוירונים בתאי ומספק להשעיה טוב תא בודד.
  2. פלייט התאים שנאספו על צלחת פולי-D-ליזין מראש ציפוי מצופה במשך 20 דקות ב CO 5% 2 37 ° C חממה. חזור עם צלחת מתוקים. התאים astroglia וכבד יירגע לדבוק את הכלים ולעזוב את הנוירונים גרגיר קטן ובתאים העצב צף. לאחר דגירה, הנוירונים גרגיר דבק בחופשיות ובתאים נוירון הם משתחררים ממקומם בקלות ושחרר עם הקשה עדינה של הצלחת.
  3. איסוף הנוירונים גרגיר ו ובתאים נוירון צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב 200xg במשך 5 דקות. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מדיום סרום ללא ולספור aliquot של μl 10 באמצעות hemocytometer.
  4. הוסף סרום ללא בינוני להגיע צפיפות התאים הרצויים. הנחיות למוזיקה מספרי התאים צלחת צפיפות בינונית: 6-גם צלחות, 3.5-4000000 תאים; עבור צלחות 4-היטב, 650,000 תאים. במשך 6 צלחות גם תרבות, אני צלחת 1.5 מ"ל / היטב במשך 4 היטב PLATES, אני צלחת 0.5 מ"ל / היטב. התאים נשמרות של 5% CO 2 37 ° C חממה. שנה את בינונית לחלוטין כעבור 24 שעות לאחר מכן עם שינויים כל יומיים שלושה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מבוסס על שינויים של נהלים אשר תוארו 3,7,11 האחרונות. ישנן מספר נקודות חשובות לציין כמפורט להלן.

הנוירונים גרגיר ו ובתאים לדבוק בתוך 2 שעות של ציפוי. בתאים בריאים יש מורפולוגיה עגול תחת 4 שלב הניגוד מיקרוסקופ. תוך 24 שעות לאחר ציפוי, תאים בריאים יתפשט באופן שווה סביב coverslips או גם פלסטיק יהוו תהליכים. בעת שינוי המדיום הראשון, לאחר 24 שעות, יהיה מספר תאים צפים מתים. זה נורמלי, כמו מספר תאים ימותו או יהיו בריאים במהלך תהליך הניתוק. עם זאת, אם לאחר 48 שעות התאים הם בכבדות יחד עם ורידים על התהליכים שלהם, בין אם התאים אינם בריאים, או את המצע poly-D-ליזין רעיל. כמו עם רוב מצעים, את היעילות של פולי-D-ליזין תלויה הרבה וכל הרבה חדש חייבים להיבדק. תמונות של תרבויות בריא ניתן למצוא הפניות 4,11, ו - 20. תאים בריאים יכול להתקיים בתרבות של עד שבועיים 8.

נוירון אבות גרגיר להתחיל להבדיל על ציפוי 8,12,13,14. לאחר ציפוי צפיפות אופטימלית היא הוקמה ללימודי שלך, זה צריך להישמר, כי התפשטות מקודמת על ידי גורמים כגון Notch איתות 15, ותאי יתרבו יותר הצפיפויות הגבוהות. התפשטות של אבות נוירון גרגיר יכול להיות ממושך באופן משמעותי על ידי הוספת סוניק הקיפוד (ששש) ל 12,13,14 בינוני. Laminin ניתן גם להוסיף כמו מצע בנוסף poly-D-ליזין לקדם תוצאה neurite 16,17. תכונות אלה של התרבות התא גרגיר מציעים מערכת ללימוד או הביולוגיה של נוירונים גרגיר או ויסות התמיינות של תאים אבות לתוך הנוירונים 6,18,19.

תאים מבודדים cerebellar מעכברים לאחר הלידה מורכבות בתחילה תערובת של נוירונים גרגיר גרגיר ו נוירון אבות בשלבים שונים של מחזור התא 8. יש גם astroglia ו interneurons נוכח בידוד / תרבות טיהור נוסף של נוירונים גרגיר גרגיר ואת אבות (95% -99%) מושגת על ידי הפרדת צבע Percoll 4. תאים מועשר גרגיר שהושג ללא שימוש הצעד ההפרדה שיפוע Percoll שימשו ללימוד הסדרת ריבוי והתמיינות של נוירון אבות גרגיר, 18,19,20. ב תימוכין לכך, אנו מוצאים כי התאים באוכלוסייה מבודדת על ידי עקיפת שלב ההפרדה Percoll שיפוע להגיב וחסונה כדי ששש ידי הנותרים מחזור התא במשך כמה ימים, וכי ללא תוספת ששש, יש ריבוי מעט מאוד בתרבויות כמצוין על ידי צביעה עם יצרנית התפשטות תאים, Ki67. עם זאת, אם התרבויות הם לשמש מעבר כמה ימים במבחנה, מומלץ כי הצעד שיפוע Percoll להיכלל להפחית זיהום של נוירונים גרגיר ידי מתרבים ללא תאים עצביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים ברברה קארלטי אנה מארי קני הצעות שלא יסולא בפז. HYL נתמך על ידי מענק הכשרה "הורמונים: לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית", DK07328. נתמך בחלקו על ידי מענק 5R01-NIH NS16951 (רמ"א).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore BD Biosciences 352350
Spinal Needle BD Biosciences 405182 20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000 Sigma-Aldrich P1024 Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll Sigma-Aldrich P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X) Sigma-Aldrich P4333
HBSS Invitrogen 14175-103 Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium Invitrogen 10888-022
Glutamax I supplement Invitrogen 35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
12-mm circle coverslips Carolina Biological 63-3029 These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips Carolina Biological 63-3037 These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System Worthington Biochemical LK 003150 Kit is good for five isolations.
Permaset scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS6782
Dumont #5 (Dumostar) Roboz Surgical Instruments Co. RS4978
4-well culture dish Nalge Nunc international 176740
6-well culture dish Nalge Nunc international 140685

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. CRC Press. Boca Raton. (1997).
  2. Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
  3. Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. Cambridge, Mass. 419-419 (1998).
  4. Hatten, M. E. The Journal of Cell Biology. 100, (2), 384-384 (1985).
  5. Carletti, B., Rossi, F. Neuroscientist. 14, (1), 91-91 (2008).
  6. Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. Cell Cycle. 5, (1), 47-47 (2006).
  7. Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, (2), 328-328 (2007).
  8. Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. Journal of Neuroscience. 26, (22), 6040-6040 (2006).
  9. Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. Neuron. 12, (2), 243-243 (1994).
  10. Palay, S. L., Chan-Palay, V. Cerebellar Cortex: Cytology and Organization. Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1974).
  11. Messer, A. Brain Research. 130, (1), 1-1 (1977).
  12. Ruiz I Altaba, A. Development. 126, 3205-3205 (1999).
  13. Wallace, V. A. Current Biology. 9, (8), 445-445 (1999).
  14. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Neuron. 22, (1), 103-103 (1999).
  15. Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. Neuron. 31, (4), 557-557 (2001).
  16. Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. Journal of Neuroscience Research. 54, (2), 233-233 (1998).
  17. Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, (7), 2183-2183 (1985).
  18. Kenney, A. M., Rowitch, D. H. Molecular and Cellular Biology. 20, (23), 9055-9055 (2000).
  19. Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. Development. 130, (1), 15-15 (2003).
  20. Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. Development. 128, 1481-1481 (2001).

Comments

1 Comment

  1. very good  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 19, 2009 - 4:59 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics