Summary
우리는 세포 굽힘 강성을 측정 광학 트랩과 커버 - 미끄럼 방지 표면에 부착된 굽힘 filamentous 박테리아 세포에 대한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
우리는 filamentous 막대 모양의 박테리아의 굽힘 강성을 측정하기위한 프로토콜을 개발했습니다. 미군은 광학 트랩, 높은 강도 레이저가 현미경의 목표 렌즈에 의해 아주 작은 지점에 초점을 맞춘 때 형성 빛이 만든 미세한 입체적인 온천과 함께 적용됩니다. 세포를 구부 위해, 우리는 먼저 화학 처리 coverslip에 사는 박테리아를 바인딩합니다. 이러한 세포의 성장에 따라, 세포의 중간 coverslip에 바인딩 남아 있지만, 성장 끝나는이 구속 무료입니다. 마약 세팔렉신와 filamentous 성장을 유도함으로써, 우리는 다른 끝이 무소속과 굽힘 세력의 영향을 유지하면서 세포의 한쪽 끝을은 표면에 붙어어진 세포를 식별할 수 있습니다. 굽힘 힘이 그러면 성장 세포의 팁에 polylysine - 코팅 비드를 바인딩하여 광학 트랩과 함께 적용됩니다. 힘 및 비드의 변위 모두 기록되고 세포의 굽힘 강성이 관계의 기울기집니다.
Protocol
- 지수 상 (OD가 = 0.2-0.4)로 Luria - Beltrani 국물 (LB) 매체 E. 대장균 세포를 성장.
- filamentous 성장을 유도 15 분 세팔렉신 50 μg / ML과 보충 LB의 문화를 성장하고 원심 분리를 통해 5 번하여 문화를 집중.
- 흐름 챔버로 물에 희석 1 % polyethylenimine을 흐르는하여 PEI - 코팅 coverslip을 확인하고, 5 분 부화 후 물로 씻으십시오.
- 챔버에 집중 세포 배양을 흐름, 그리고 무소속의 세포를 제거하는 3 분 후 LB 및 세팔렉신 (50μg/mL)의 혼합물로 세탁.
- 37 챔버를 품어 ° C가에 대한 연결된 세포 광학 트래핑 악기에 배치하기 전에기를 30 분 - 1 시간.
- 30 분 물에 희석 0.1 % polylysine에서 0.5 - μm의 지름의 폴리스티렌 비즈 (뱅스 연구소)을 잠복기로 polylysine - 코팅 구슬을 만듭니다. 다음 비즈에게 3 번 씻은 후 물에 resuspend.
- 세팔렉신 (50μg/mL)와 LB에 두 요소에 의해 비드 솔루션을 희석하고, 흐름 챔버로를 추가합니다.
- 광학 부동 구슬을 함정과 세포의 자유로운 끝에 그것을 만져. (우리는 샘플의 움직임을 제어하는 미친 도시 연구소 압전 단계를 사용합니다.) 적합한 전지 / 구슬 조합이 발견되면, 무소속의 구슬을 제거 LB (50μg/mL)에 세팔렉신와 챔버를 세척.
- 셀 및 기록 힘 - 변위 데이터를 절곡 세력을 적용하는 맞춤 작성된 LabView 프로그램을 실행합니다. 프로그램 세부 정보
- 래스터는 감지 레이저 빔 및 녹화 3D PSD 전압 신호 내에 첨부된 비드를 검색하여 검출기 응답을 보정합니다.
- 현미경 이미지의 세포 긴 축을 식별합니다.
- 세포 긴 축에 직각 방향으로 단계에서 세포로 이동합니다.
- 광학 트랩에서 거리 이동과 변위를 기록합니다.
- 이전에 측정된 트랩 강성을 사용하여 강제로 적용 변위 변환 및 팁 변위 및 파일 강제 저장합니다.
성공에 비밀 : 8 단계에서), 하나는 잘 정의된 붙어 끝에있는 세포를 찾을 수 있어야합니다. 일부 세포는 단지 다른 끝에 하나의 팁 및 굽힘 강제에 붙어있는 것은 전체 셀 pivoting보다는 굽힘 발생합니다. 적당한 쌍을은 조이스틱 제어 스테이지 모션을 사용하여 수동으로 신속하게 각각의 세포를 굽힘에 의해 발견됩니다.
대표 결과 :
그림 1.이 그림은 하나의 세포에 대한 힘 - 변위 데이터를 보여줍니다. 이 라인의 경사가 세포의 굽힘 강성이다.
Discussion
여기에 제시 프로토콜은 양적 세균 세포의 굽힘 특성을 측정하기 위해 설계되었습니다. 실험 설정은 filamentously 성장을 만들 수있는 막대 모양의 세포에 적용할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 E.의 굽힘 강성에 cytoskeletal 필라멘트의 효과를 조사하기 위해이 설정을 사용해야 대장균 세포. 이 같은 기술은 세포의 전반적인 굽힘 강성을 결정하는 압력, 셀 벽의 강성 및 기타 세포 구성 요소의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Disclosures
이 문서의 비디오 제작은 이러한 연구에 사용되는 악기를 생산 매드 도시 연구소에 의해 후원되었다.
Acknowledgments
우리는 표면에 바인딩 세포에 Mingzhai Sun에서 유용한 조언을 인정합니다. 우리는 귀중한 토론 네드 윈그린 및 Zemer Gitai 감사드립니다. 이 연구는 보건 부여 P50GM07150 국립 연구소, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 보너스 PHY - 0844466과 알프레드 P. 슬로안 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
