破骨细胞是体内主要的骨吸收细胞。能够大量分离破骨细胞，已显著推动了对破骨细胞生物学特性的理解。在本方案中，我们描述了一种分离、培养及定量破骨细胞活性的方法 体外.
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本文内容
摘要
摘要
破骨细胞是一类高度特化的细胞，起源于骨髓中的单核/巨噬细胞谱系。它们具有降解骨组织中有机和无机基质的独特能力，因此在调控骨骼重塑过程中发挥着关键作用。成骨细胞与破骨细胞共同负责动态偶联过程，在健康和疾病状态下通过骨吸收与骨形成协同作用，维持正常骨骼结构。
作为体内主要的骨吸收细胞，破骨细胞的分化或功能改变可能对机体产生显著影响。破骨细胞功能异常相关的疾病严重程度不一，轻者如骨质疏松症，因破骨细胞过度吸收骨组织而易于导致骨折；重者可表现为致死性新生儿疾病，由于无法形成骨髓腔以支持造血功能所致。
大量分离破骨细胞的能力 体外 显著推动了对骨重建循环的理解，并为发现治疗这些疾病的新疗法策略奠定了基础。
本文介绍一种从小鼠骨髓中分离和培养破骨细胞的方案，可获得大量破骨细胞。
引言
骨重建是一个动态过程，涉及骨形成与骨吸收的偶联1。这一高度调控的过程在维持正常体内平衡以及应对损伤和疾病时，对骨骼系统的维持起着关键作用。
破骨细胞是一类独特的多核细胞，能够吸收骨组织中的有机基质和无机基质。破骨细胞起源于骨髓的单核细胞/巨噬细胞系2-5。破骨细胞功能或形成异常可导致多种临床病理状态，包括骨质疏松等常见疾病。
生成破骨细胞的能力 体外 极大地推动了我们对骨生物学的理解6因此，针对破骨细胞相关疾病的新治疗药物正在不断涌现，这类疾病是导致显著发病率和死亡率的重要原因。7骨量和骨强度的稳态维持需要成骨细胞和破骨细胞的协同作用8,9骨稳态在多种疾病中发生改变，包括绝经后骨质疏松症，其中破骨细胞活性增强导致骨量和骨密度的病理性下降10随着人类疾病转基因小鼠模型的日益普及，人们将有更多机会解析破骨细胞在人类骨骼疾病中的作用。11-13.
文献中报道了多种破骨细胞培养技术方案，描述了诸多不同的实验变体9,12,14. Xing 及其同事在其关于从小鼠骨髓细胞进行破骨细胞生成检测的描述中，介绍了与下述方案类似的方法。然而，在收获长骨后释放骨髓细胞时，Xing 等
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方案
注意：伦理声明：所有涉及脊椎动物的研究均按照斯坦福大学实验室动物护理行政小组（APLAC）批准的协议进行。
1. 准备
- 将10 ml市售的密度梯度细胞分离介质（含有聚蔗糖和泛影酸钠，密度调节至1.077 g/ml）置于50 ml锥形管中，恢复至室温。
- 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）与2%胎牛血清（FCS）配制流式细胞术（FACS）缓冲液。取50 ml分装，并在密度梯度细胞分离介质操作步骤期间保持该分装液处于室温。
- 准备一桶冰，用于在细胞分离过程中保持组织和细胞的低温状态。
2. 准备培养基
- 配制基础培养基：不含酚红的最低必需培养基（MEM，500 ml）、谷氨酸（1×）、胎牛血清（FCS，10×）、10,000 单位/ml 青霉素（1×）。
- 使用 0.22 μm 滤器过滤基础培养基。
- 配制骨髓巨噬细胞诱导培养基：
- 取 步骤 2.1 中配制的基础培养基 50 ml。
- 加入前列腺素 E2（PGE2，分子量 352.465 g/mol），终浓度为 10-7 M。
- 加入巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），终浓度为 10 ng/ml。
- 骨髓巨噬细胞诱导培养基的终溶液无需过滤。 <....
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结果
该方法的目的是简便地分离出大量破骨细胞 体外，通常在一周内完成。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP染色）确认成功分离出大量破骨细胞。图1A）。大的破骨细胞呈现为具有多个细胞核（通常 ≥ 3 个细胞核）的大型紫色细胞。采用本方案，常可分离出每个破骨细胞含有多达 30 个细胞核的破骨细胞（图1B).
使用矿化表面被认为是体外评估破骨细胞吸收活性的金标准方法。in vitro。通过该方法，可测定已形成的矿化表面百分比，即“吸收陷窝”，从而确定破骨细胞的吸收能力（图2）。
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讨论
轻松分离并大量培养破骨细胞的能力 体外 在促进骨生物学及破骨细胞介导疾病的认知方面发挥了重要作用。这一进展源于RANKL的发现，该分子最近被确认为调控破骨细胞形成、分化及存活的主要因子。16-18.
根据我们的经验， 体外 骨髓来源破骨细胞的培养在很大程度上依赖于接种密度。我们观察到，本实验方案未能成功获得破骨细胞，通常是由于骨髓来源细胞在铺板时接种密度未达到最佳条件所致。因此，本方案建议在24孔板的每个孔中接种200,000个细胞。此外，为最大限度提高该技术的成功率，建议严格按照上述方法配制破骨细胞诱导培养基，并在最初3天不干扰培养板后，自第4天起每天固定时间更换培养基，以维持破骨细胞诱导因子的稳定浓度。另外，我们发现使用特定试剂也有助于更高效地培养出大量多核破骨细胞。
该技术受限于能否获得可调节加速度和减速度参数的常温离心机，以及特定试剂的获取。除此之外，本方案非常简便，我们在不同年龄和遗传背景的小鼠中均取得了良好的实验效果。例如C57BL/6、C.......
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披露
所有作者均无披露事项或利益冲突需要声明。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 DE021683、R01 DE019434、U01 HL099776、Oak基金会以及Hagey儿科再生医学实验室的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含谷氨酰胺和酚红的MEM培养基 | Gibco | 51200-038 | |
| 重组小鼠M-CSF | Gibco | PMC2044 | |
| 重组小鼠TRANCE/RANK L/TNFSF11（E. coli表达） | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| 前列腺素E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 酸性磷酸酶（TRAP）检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | 387A | |
| 骨吸收检测板，24孔板 | Corning Life Sciences | 3987 |
参考文献
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investi....
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