Abstract
ההתנהגות של נדידת תאים כיוונית תחת שדה חשמלי הנוכחי ישיר (dcEF) נקראת electrotaxis. התפקיד המשמעותי של dcEF הפיזיולוגי במנחים תנועת תא במהלך התפתחות עובר, התמיינות תאים, וריפוי פצע הודגם במחקרים רבים. על ידי יישום שבבי מייקרו-נוזליים לassay electrotaxis, תהליך החקירה מתקצר ושגיאות ניסיוניות הן מזעריות. בשנים האחרונות, מכשירי microfluidic עשויים חומרים פולימריים (לדוגמא, polymethylmethacrylate, PMMA, או אקריליק) או polydimethylsiloxane (PDMS) היה בשימוש נרחב בלימוד התגובות של תאים לגירוי חשמלי. עם זאת, בניגוד לרב נדרשו כדי להמציא מכשיר PDMS צעדים, הבנייה הפשוטה ומהירה של מייקר אקריליק fl שבב uidic הופכת אותו מתאימה לשני אב טיפוס המכשיר וייצור. עם זאת, אף אחד מהמכשירים דיווחו להקל על המחקר יעיל של חומר כימי בו זמנית וDCEהשפעות F על תאים. בדו"ח זה, אנו מתארים העיצוב והייצור של שבב רב-ערוצי מבוססי אקריליק חשמלי-שדה-כפול (MDF) כדי לחקור את ההשפעה הזמנית של כימי וגירוי חשמלי על תאי סרטן הריאות שלנו. שבב MDF מספק שמונה שילובים של גירויים חשמליים / כימיים בבדיקה אחת. השבב לא רק מקצר מאוד את זמן הניסוי הנדרש, אלא גם מגביר את הדיוק בelectrotaxis לימודים.
Introduction
התנהגותם של תאים חסיד נעו לעבר אנודה או קתודה תחת שדה חשמלי הנוכחי ישיר (dcEF) נקראת electrotaxis. התנהגות electrotactic של תאים ממלאים תפקיד משמעותי בעובר, התחדשות של עצבים, וריפוי פצע. תאי גידול 1 כגון תאי ערמונית עכברוש סרטן, תאי סרטן שד 2, 3 וריאות תאי אדנוקרצינומה 4-8 הראו תנועת electrotactic תחת dcEF מיושם . EF הפיזיולוגי כבר נמדד ברקמות בלוטה. 9,10 Electrotaxis דווח גם בתאים סרטניים הקשורים בלוטה. 2,3 יחדיו, electrotaxis של תאי הסרטן נחשב לגורם גרורות. 11 שליטה ההדרכה החשמלית של תאים סרטניים תחת dcEF עשויים להיות גישה פוטנציאלית לטיפול העתידי בסרטן. עם זאת, היום, המנגנון המולקולרי מפורט של electrotaxis נותר שנוי במחלוקת. לכן, חקירה של INFluence של גירוי חשמלי על נדידת תאי הסרטן יכול להקל על פיתוח אסטרטגיות לטיפול בסרטן.
לאחרונה, מכשירי יו-microfluidic כבר מפוברקים ללימוד תגובות הסלולר לזרום כוח גזירה, 12 מילויים כימיים, 13 ו חשמל גירויים 4 במבחנה. הייצור של מכשירים ביו-microfluidic באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS) או polymethylmethacrylate (PMMA, הידוע גם באקריליק) צמצם בהצלחה שיעור הכישלון של ניסויים כאלה. יתרה מזאת, שימוש בהתקני מייקרו-נוזליים מבוסס אקריליק כמו אב טיפוס לחקירת נושאים ביולוגיים הוא פשוט יותר מאשר באמצעות שבבי PDMS. תפקידים שונים במכשירים מבוססי אקריליק פותחו עבור electrotaxis מחקר. עם זאת, אף אחד מהעיצובים הקודמים יכול לבדוק בו זמנית ההשפעות של תנאים כימיים שונים ושדה החשמלי על תאים לelectrotaxis מחקר. לפיכך, פיתחנו מכשיר-mu microfluidicltichannel כפול חשמלי-שדה (MDF) ארבעה ערוצי תרבות עצמאיים ושמונה תנאי ניסוי שונים בשבב אחד המכיל שבב.
שבב MDF מבוסס אקריליק, דווח לראשונה על ידי הו et al., 8 משלב גירוי חשמלי וכמה ערוצים מבודדים כימי. ערוצים מבודדים כימי אלה יכולים לשמש לתרבות סוגים שונים של תאים בניסוי אחד. DcEF בערוצים מופק על ידי אספקת חשמל. שני שדות חשמליים עצמאיים, אחד עם כוח שימושי חשמלי-שדה (EFS) ועוד עם 0 EFS, נערכים בכל ערוץ כימי מבודד. בדרך זו, השבב מספק EF coexisting שליטה טובה יותר וגירוי כימי. יתר על כן, תוצאות מהסימולציה נומרית של דיפוזיה הכימית בתוך שבב MDF מצביעות על כך שאין זיהום לחצות אירע בין הערוצים לאחר תקופת ניסוי 24 שעות. 8
לעומת דוויCE דווח על ידי Li et al., 14 השבב MDF מספק אזור תרבות גדול יותר, המאפשר לאנליזה ביוכימית נוספת של תאי גירוי חשמלי. בנוסף, עם אזור התצפית הגדול יותר של שבב MDF, ניתן לצפות יותר תאים במבחן, כך הניתוח של מהירות הגירה או הכוונה של תאי מגורה חשמלי הוא מדויק יותר. עיצובי השבב בודדים הערוצים של מחקרים קודמים שדווחו על ידי הואנג et al. 4 וצאי et al. 15 מאפשרים רק סוג אחד של תא או כימי להיבדק. עם זאת, שבב MDF יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של כימיקלים שונים על electrotaxis, כמו גם את ההשפעות של גירוי חשמלי בסוגים שונים של תאים. במילים אחרות, שבב MDF מאפשר מחקר יעיל של תלות מינון כימית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב וייצור של שבב MDF
- צייר דפוס שכבת אקריליק בודד באמצעות תוכנה מסחרית, כגון AutoCAD, ולשמור את התבנית.
- סקור את העיצוב של תבנית גיליון אקריליק ארבע-שכבה בתרשים 1 א ו לאשר את הקשרים הבין-שכבה.
- לפברק את כל גיליונות אקריליק ודבק דו צדדיות על ידי אבלציה לייזר באמצעות חרט CO 2 לייזר (1B דמויות, 2A, ו2B). 16
- הפעל את חרט הלייזר ולחבר את המכשיר למחשב נייד השליטה.
- הפעל את התוכנה המסחרית ולפתוח את התבנית נועדה בשלב 1.1 על ידי לחיצה על "קובץ תבנית נועדה."
- מניחים פיסת גיליון אקריליק הריק או הקלטת דו צדדית על הבמה XYZ של חרט הלייזר.
- הגדר את מוקד קרן הלייזר על פני השטח של גיליון אקריליק או קלטת דו צדדית עם-alignmen אוטומטילא מקל הניתן על ידי היצרן של חרט הלייזר.
- שלח את התבנית נועדה חרט הלייזר לעיבוד ישיר של גיליון אקריליק או סרט דו-צדדי.
- הסר את מגן הנייר מגיליונות אקריליק באמצעות מלקחיים ולפוצץ המשטח נקי עם גז חנקן.
- מחסנית גיליונות אקריליק והאג"ח יחד תחת לחץ של 2 קילוגרם / 2 סנטימטר בונדר תרמית במשך 45 דקות ב 110 ° C כדי ליצור את הזרימה / ההרכבה ערוץ גירוי חשמלית.
- הכן את מכסה זכוכית מיקרוסקופ כמצע תרבית תאים בשבב.
- שים את מכסה הזכוכית לתוך צנצנת מכתימה ולמלא את הצנצנת עם דילול פי עשרה של חומר הניקוי מופיע ברשימת החומרים.
- שים את מכסה הזכוכית וצנצנת מכתימה בSteri-שואב קולי ולנקות את מכסה הזכוכית במשך 15 דקות.
- יוצקים את סבון הכלים המדולל מתוך הצנצנת מכתימה, למלא את הצנצנת במים מזוקקים, וחזור על שלב 1.5.2 3 פעמים.
- לייבש את מכסה הזכוכית ניקתה ידי פיצוץ אותו עם גז חנקן לפני דבקותו לסרט דו-צדדי.
- לדבוק מכסה הזכוכית ניקתה לזרימה / ההרכבה ערוצי גירוי חשמלית עם הסרט דו-צדדי בדוגמת בשלב 1.2.
- לדבוק 13 חתיכות של מתאמי אקריליק לפתחים הבודדים בLayer 1 להרכבת שבבי MDF עם דבק סופר. ההרכבה שבבי MDF היא אז שלם (איור 2 ד).
- לעקר את ההרכבה שבב MDF המלאה עם 30 דקות של קרינת UV לפני השימוש.
2. התקנה של רשת גשר מלח של צ'יפ MDF
- לפני שימוש, לעקר את כל צינורות הפלסטיק, אגוזי אצבע הדוקה, וצינורות microcentrifuge מוצגים באיור 3 על ידי הגדרת זמן החזקה של 15 דקות ב 121 ° C בחיטוי.
- חבר את צינורות fluoroplastic (איור 3-i) להרכבת שבבי MDF באמצעות הכניסה בינוניתמתאמים לשקע מוצגים בתרשים 1 א.
- חבר להתחדד Luer של הכניסה ויציאה בינוני צינורות פלסטיק באיור 3-i לברזים למיניהם 3-הדרך.
- קח -2.5 מיליליטר של CO 2 מלוח -equilibrated פוספט שנאגרו (PBS) באמצעות מזרק 3 מ"ל ולחבר את המזרק לברזלי 3-הדרך של צינור פלסטיק כניסה. חבר מזרק 3 מיליליטר ריק לברזלי 3-הדרך של צינור הפלסטיק לשקע. שני המזרקים בכך מחוברים באמצעות שבב MDF.
הערה: דגירה PBS ב37 מעלות צלזיוס 5% -CO O תרבות חממת 2 תא / N להשיג CO 2 -equilibrated PBS. - לאטום את הפתחים של כחול והירוק מתאמים (איור 1A) בגיליון PMMA שכבת 1 עם אגוזי אצבע חזק מוצקים לבנים (איור 3-ג).
- מלא את ערוצי גשר מלח ותאי תרבות עם CO 2 -equilibrated PBS במזרק המתואר בהתקנת שלב 2.4. לְהִמָנַעהיווצרותן של בועות.
- בשלב הבא, לשים CO 2 -equilibrated PBS המכיל שבב MDF ב5% -CO תרבות חממת 2 תא 37 ° C / O דגירה N. זו מאפשרת לאוויר מומס בקלטת דו צדדית כדי ליצור בועות בתאים.
- רוקן משם הבועות בערוצים על ידי זרימת PBS מהירה בערוץ באמצעות שני המזרקים. לשאוב PBS הלוך ושוב במידת צורך.
- מסננים את PBS בערוצים באמצעות ברזלים 3 הכיוונים מחוברים לצינור לשקע הבינוני.
- באמצעות מזרק 3 מ"ל חדש, לקחת 2.5 מיליליטר של CO 2 -equilibrated הנשר השתנה Dulbecco בינוני (DMEM) (ראה שלב 3.5), ולהחליף המזרק מחובר לכניסה עם אחד החדש. למלא את הערוצים עם המדיום.
- הכנה של רשת גשר מלח.
- באופן זמני להוציא את האגוזים הסולידיים (3B-iii תרשים) במתאמים הירוקים (איור 1 א), ולהזריק% 3 חם (> 70 ° C) agarose לBRI מלחערוץ dge דרך הפתח במתאמים הירוקים (איור 1 א).
הערה: הכנת החם agarose: ממיסים 1.5 גרם של אבקת agarose 50 מיליליטר של PBS. לעקר על ידי הגדרת זמן החזקה של 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס בחיטוי. - להפסיק הזרקת agarose כאשר הנוזל ממלא שלושה רבעים מאורכו של ערוץ גשר מלח.
- לאטום את הנקבוביות במתאמים הירוקים (איור 1 א) על ידי הברגת אגוזים מוצקים (איור 3-ג) לאחר הזרקת agarose.
- החלף את האגוזים מוצקים על המתאמים הכחולים (איור 1 א) עם האגוזים השקופים צינורי אצבע חזק (איור 3).
- טען את 3% מחוממים מראש agarose לאגוזי צינורי (איור 3B-IV).
- להטביע את האלקטרודות Ag / AgCl (איור 3-V) לאגוזי צינורי (איור 3-IV) לפנימיצוק של agarose.
- באופן זמני להוציא את האגוזים הסולידיים (3B-iii תרשים) במתאמים הירוקים (איור 1 א), ולהזריק% 3 חם (> 70 ° C) agarose לBRI מלחערוץ dge דרך הפתח במתאמים הירוקים (איור 1 א).
- לאחר שסיים את ההתקנה של רשת גשר מלח, להזריק את תאי סרטן ריאות CL1-5 לתאי התרבות, קאמרית אחד בכל פעם.
3. הכנה של תאי הסרטן ולהגדיר לניסוי Electrotactic
- תרבות רגילה של שורת תאי סרטן ריאות CL1-5.
- תרבות תאי CL1-5 סרטן ריאות, המתקבלים מפרופ 'פאן-Chyr יאנג, 17 במדיום השלם בבקבוק תרבות תא 75T ב 37 ° C באווירת 5% CO 2. הבינוני השלמה מורכב מDMEM ו -10% בסרום שור עוברי (FBS). תת-תרבות התאים כל 3-4 ימים. התאים המשמשים לביצוע ניסויי electrotaxis פחות מ -25 קטעים מהמקור המקורי.
- להוסיף 2 מיליליטר של 0.25% חיץ טריפסין לתאי CL1-5 גדלו באופן אקספוננציאלי ודגירה של 2 דקות ב37 חממת תרבות -CO -2 סלולארי מעלות צלזיוס -5% לdetachmen סלולארילא.
- לסיים את תהליך הניתוק עם 6 מיליליטר של 10% DMEM FBS וצנטריפוגה התאים ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. אז להשליך את המדיום ולהשעות את התא גלולה עם 5 מיליליטר של PBS.
- לספור את מספר התאים בPBS. אז קח 1 x 10 6 תאים ו צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות בRT.
- מחק את PBS. להשעות את התאים עם CO 2 מראש חימם -equilibrated DMEM ולהתאים את צפיפות התאים להיות 1 × 10 6 תאים / מיליליטר.
הערה: דגירה בינונית המלאה ב37 מעלות צלזיוס 5% -CO O 2 תאי תרבות החממה / N להשיג CO 2 -equilibrated DMEM.
4. הגדרה לניסוי Electrotactic
- משקע של שבב MDF, להזריק 0.3 מיליליטר, 1 × 10 6 / מיליליטר, של התאים לתוך השבב.
- דגירה שבב MDF תא-זרע בתרבית תאי החממה (שנקבע על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2) במשך 2-4 שעות.
- התקנה של מיקרו MDFמערכת fluidic.
- התקן את מערכת microfluidic MDF על דוד זכוכית תחמוצת אינדיום בדיל שקופה (איטו). מדוד את הטמפרטורה של שבב MDF עם צמד תרמי K-סוג המקוטע בין שבב MDF וזכוכית איטו. לשלוט על דוד איטו עם בקר פרופורציונאלי נפרד נגזרים (PID). הגדר את טמפרטורת הדגירה מערכת MDF microfluidic 37 ° C עם בקר PID.
הערה: הייצור של דוד איטו וההתקנה של מערכת חימום תא התרבות מתוארות בדוחות קודמים 18,19. - הר ההרכבה שבב MDF בטמפרטורה מבוקרת על הבמה הממונעת מבוקר מחשב XYZ על מיקרוסקופ הפוכה. השימוש בבמה הממונעת מתואר בשלב 5.1. לשאוב את המדיום המלא לתאי התרבות דרך פתחי הכניסה עם משאבת מזרק ארבעה ערוצים.
- התקן את מערכת microfluidic MDF על דוד זכוכית תחמוצת אינדיום בדיל שקופה (איטו). מדוד את הטמפרטורה של שבב MDF עם צמד תרמי K-סוג המקוטע בין שבב MDF וזכוכית איטו. לשלוט על דוד איטו עם בקר פרופורציונאלי נפרד נגזרים (PID). הגדר את טמפרטורת הדגירה מערכת MDF microfluidic 37 ° C עם בקר PID.
- לשאוב בינוני המלאה לשבב MDF זרימה בשיעור של 20 μl / שעה. פסולת מהתרבות החוצהמאפשר נאסף בצינורות microcentrifuge (כפי שמוצגים "בזבוז" באיור 3 א).
- דגירה תאים לעוד שעה 16-18 על 37 מעלות צלזיוס בשבב MDF.
- כדי להחליף את המדיום, לשאוב את המדיום המכיל 50, 25, 5, ו -0 מעכב קינאז מיקרומטר, בהתאמה, לכל חדר תרבות בקצב זרימה של μl 20 / דקה במשך 10 דקות.
הערה: הכן פתרון מניות מ"מ 10 לY27632 מעכב החלבון kinase הקשורים-Rho על ידי הוספת 3 מיליליטר של מים סטריליים למעכבי קינאז 10.6 מ"ג. לדלל את פתרון מניות 10 מ"מ עד 50, 25, ו -5 מיקרומטר, בהתאמה, באמצעות 10% בינוניים FBS DMEM. - דגירה התאים במעכבי קינאז לעוד 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס. להגדיר את קצב הזרימה הבינוני עד 20 μl / שעה. השתמש באותה טמפרטורת התרבות וקצב זרימה שתואר לעיל בצעדים מאוחר יותר.
- השתמש בחוטי חשמל לחיבור אספקת חשמל DC לשבב MDF באמצעות אלקטרודות Ag / AgCl על השבב.
- סדרתי להתחבר אני מד זרםn המעגל החשמלי. השתמש במד הזרם כדי לפקח על הזרם החשמלי בשבב MDF.
- הפעל את אספקת חשמל DC ולהגדיר את מד הזרם הנוכחי ל86.94 מיקרו-אמפר על ידי התאמת מתח אספקת חשמל לבין 15 ל 19 V.
הערה: בהתחשב חוק אוהם, E = I / (EFF σA), שבו אני הוא הזרם החשמלי זורם דרך החומר בתפזורת, כלומר, מדיום התרבות בתא electrotactic, σ (= 1.38 Ω -1 מ '- 1) הוא מוליכות של מדיום התרבות, EFF (= 0.21 מ"מ 2 לרוחב 3 מ"מ × 0.07 מ"מ גובה) היא האזור היעיל חתך של תא electrotactic, והזרם החשמלי (I) נדרש ליצור mV / מ"מ 300 EF בשבב MDF הוא 86.94 מיקרו-אמפר.
5. רכישה וניתוח של תמונות ניידים
- שולט בשלב הממונע באמצעות תכנית MATLAB GUI. עם מערכת microfluidic MDF רכובה על microscoPE, להעביר את השבב לאזורי תצפית שימוש בשלב הממונע.
- דימויי שיא סלולריים באמצעות מצלמת רפלקס דיגיטלי (SLR) רכובים על המיקרוסקופ.
- קח תמונות מיקרוסקופיות באמצעות עדשה אובייקטיבית 4X במרווחים של 15 דקות לשעה 2.
- ניתוח נדידת תאים.
- הפעל V. NIH ImageJ 1.47
- לנתח את המרחק מהראשוני לעמדות הסופיות של centroid של התא.
- עבור אל "קובץ" → → "יבוא" "תמונה ברצף," ולייבא תשע תמונות לניתוח נדידת תאים. את התמונה הראשונה היא התוצאה של אפס זמן, והתמונה האחרונה היא התוצאה של 120 דקות.
- עבור ל" לנתח "→" קבע מדידות "וסמן את התיבה שליד" מרכז הצורה "
- לחץ על הסמל "בחירות Freehand".
- מתאר את הקצה של התאים שנבחרו בדימוי הראשון.
- עבור ל" ערוך "→ "בחירה" → "הוסף למנהל"
- עבור לתמונה התשיעית ומציג את הקצה של אותם תאים שנבחרו בתמונה הראשונה. ניתן לייחס עמדות התא באמצעות השנייה לתמונות שמינית.
- עבור ל" ערוך "→" מבחר "→" הוסף למנהל "
- 5.4.5 חזור על שלבים ל5.4.9 לאסוף נתונים 90-100 בתאים.
- עבור ל" לנתח "" מדוד "→ להשיג התוצאה של העמדות הראשוניות וסופיות של התאים שנבחרו.
הערה: מהירות ההגירה מוגדרת כאורך תנועת תא הממוצע לשעה. ההכוונה מוגדרת כקוסינוס, שבו הוא הזווית בין הווקטור של dcEF (מהאנודה לקתודה), ואת הווקטור מנקודת ההתחלה של תא לעמדתה הסופית. ההתכוונות היא -1 לתאים הנודדים לעבר האנודה ו+1 לתאים הנודדים לכיוון הקתודה. לקבוצה של באופן אקראי מילצורם בתאים, ההכוונה היא 0. -2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ייצור והרכבה של מכשיר MDF
תרשים סכמטי של שבב MDF מבוסס אקריליק מוצג באיור 1 א. ארבעה גיליונות אקריליק, כוס אחת כיסוי, 13 מתאמי אקריליק, ונייר דבק דו-צדדי שמשו בהרכבה של שבב MDF השלים (איור 2 ד). יש רק ארבעה ערוצים עצמאי תרבות במכשיר MDF. עם זאת, רשת גשר מלח על השבב יוצרת שמונה תנאי ניסוי שונים במגזרי שמונה של השבב. שלושה גשרי מלח (הערוצים הכחולים בשכבה 2 של איור 1 א,) 79, 90, ו -80 מ"מ באורך, היו מצמידים את השכבה השנייה של שבב MDF בלי להתערב עם תצפית התמונה. הנקבוביות הקטן (ערוצי כחול קוביות בשכבות ו 3 4 של איור 1 א) בין רשת גשר מלח וחדרי התרבות, שיש לי 0.25 מ"מ 2 אזור החתך, למזער את שטף הנוזל לגשר מלח במהלך הניסוי. אזור התרבות של שבב MDF הוא כ -74 מ"מ 2 בכל מגזר. בהפגנה זו, תאי תרבית תאים של מכשיר MDF מורכבים מהזכוכית דו צדדית העבה 70 מיקרומטר הקלטת וכיסוי. עם זאת, אם תנאים שונים תרבית תאים (לדוגמא, דרישת ציפוי קולגן, זרימת גזירה נמוכה, או תרבות הגדולה בינוני נפח בתא התרבות) נחוץ למחקר electrotaxis, שני מצעי התרבות והקלטות יכולים להיות מוחלפות בקלות. לכן, סוגים שונים של תאים יכולים לשמש לelectrotaxis מחקר בתוך שבב MDF.
תצורה של מערכת microfluidic MDF
הגדרת מערכת microfluidic MDF מודגמת באיור 3 א. הרכיבים מוצגים באיור 3 הם used להקים זרימה בינונית ורשת הזרם החשמלית במערכת microfluidic MDF. הצינורות מחוברים עם האגוזים החלולים האצבע צמודה (אדומים וירוקים), ונרות Luer (חום) בתרשים 3B-i משמשות להובלה בינונית לזרימת רשת MDF. לאחר המזרקים היו קשורים לנרות Luer והתיישבו על משאבת ארבעת ערוצים, מערכת צינור הזרימה הייתה מלאה. תרבות בינונית ופסולת מועברים דרך המערכה ההולכה. בגלל הקשר בין הצינורות ומתאמי אקריליק מהודק על ידי מחברים דפוקים, הרשת בינוני MDF יכולה לסבול לחץ הידראולי גבוה מיכול מערכת PDMS. בשל חדירות האוויר נמוכות הקיצוניות של אקריליק הגיליונות והצינורות, כל קשר בין הרשת בינונית והסביבה מחוץ נחסם. לכן, ערך ה- pH של המדיום במערכת נותר יציב, ויכולים להיות מתורבת תאים באמצעות מערכת microfluidic MDF מחוץ חממת CO 2. מאז פרק MDFIP מותקן בשלב ממונע, ניתן למצוא תמונות של תא הזמן לשגות שמונה חלקים בודדים. הצינורות עם תחתית הפתוח microcentrifuge (איור 3-ב) הם רכובים על אגוזי אצבע צמודה צינור השקוף (איור 3-IV) כדי להגדיל את קיבולת נפח agarose. בדרך זו, ניתן להכניס אלקטרודות גדולות יחסית לagarose לספק גירוי חשמלי יציב לתאים לתקופות זמן ארוכים יותר.
דור של שדה חשמלי הנוכחי ישיר מצויינים בשבב MDF
המתח של כל תא ניתן למדוד באמצעות אלקטרודות מושתלים בשבב המחובר למעגל החשמלי. עם זאת, אנחנו לא מודדים את המתח בחדר. במקום זאת, אנחנו מדומים השדה החשמלי ברשת גשר מלח ותאי תרבית תאים של השבב. ארבעה תאי electrotactic היו סדרתי קוןnected במעגלים חשמליים. באופן זה, באותו הזרם חשמלי נשמר שבכל אחד מן התאים אלה. על פי חוק אוהם, EFS בקורלציה עם השטח של החתך של התאים במכשיר microfluidic. כמו כן, כל גיליונות PMMA הקלטות היו מפוברקים על ידי חרט לייזר CO2. היישור של חלקי ההרכבה השבב הוא מדויק והפגמים המבניים של השבב הם מינימאליים. לפיכך, EFS בכל תא צריך להישאר יציב. תוצאות הסימולציה שדה חשמליות להראות הפצה הומוגנית של EFS עם 300 ו 0 mV / מ"מ בחצי הראשונים וחצי הנותרים של תאי התרבות במכשיר (מידע לא מוצג). בעבר, מדווח מהמעבדה שלנו, et al הואנג. וצאי et al., הראה כי ההבדל במדוד וערכי EFS המדומה היה פחות מ -4%. 4,15 תוצאה זו מראה כי, במערכת שלנו, השדה החשמלי שנמדד מתאימה היטב עם הערך המדומה. בw זהork, אנו מוכנסים אלקטרודות Ag / AgCl גדולים כדי לספק זרם חשמלי יציב לניסוי ארוך. הנוכחיים מיושמים על שבב MDF ירד רק 1.85 ± 0.19% לאחר 7 שעות של גירוי EF בניסויי electrotaxis. יתר על כן, התקופה הארוכה ביותר של גירוי החשמלי היו 4 שעות במחקר שלנו. לפיכך, אנו מאמינים הזרם החשמלי הקלט נותר יציב במהלך בדיקת electrotaxis, והשדה החשמלי בתאי electrotactic של שבב MDF מנוטר על ידי מד הזרם המחובר באופן סדרתי.
חקירה של electrotaxis של תאי סרטן ריאות באמצעות מערכת microfluidic MDF
הרגולציה electrotactic של קינאז סליל מפותל קשור-רו (ROCK) הודגמה בשחלה הסינית אוגר (CHO), 20 אנדותל, 21 ותאים עצביים 22 אבל עדיין לא נחקרה לסרטן הריאות גאמות. לכן, מעכב ROCK, Y27632, יושם למערכת microfluidic MDF ללמוד את השפעתה על electrotaxis של תאי סרטן הריאות. כפי שניתן לראות באיור 4, טיפול בY27632 לא הראה כל השפעה בשינוי מהירות נדידת תאים עם או בלי גירוי חשמלי. עם זאת, היישום של Y27632 לתאי סרטן תחת dcEF (300 mV / מ"מ) צמצם באופן משמעותי הגירת anodic. בריכוז 50 מיקרומטר-, מעכב ROCK בוטל תנועת anodic של תאי סרטן הריאות, אך לא להשפיע על מהירות הגירתם. יתרה מזאת, היה מתאם תלוי-מינון בין הריכוזים הכימיים שיושמו ומדד ההתכוונות (איור 4). תוצאות אלו מצביעות על כך שמערכת microfluidic MDF היא אמינה ויעילה ללימוד electrotaxis.
איור 1. DesIGN של שבב MDF. (א) ציור סכמטי של שבב MDF. מכשיר MDF מורכב מארבע שכבות של יריעות אקריליק (72 × 50 מ"מ), 13 מתאמי אקריליק (10 × 10 × 6 מ"מ), סרט דו-צדדי, ומכסה זכוכית (24 × 60 מ"מ). העובי של גיליון אקריליק שכבת 2 הוא 2 מ"מ ושלוש שכבות האחרות הן כל 1 מ"מ. בשלוש השכבות הנמוכות אקריליק, גשר מלח וזרימת רשתות בינוניות מיוצגים על ידי בלוקים הכחולים ואדומים, בהתאמה. בשכבת גיליון אקריליק הראשונה, מתאמי אקריליק ירוקים שמשו לזריקה של agarose. מתאמי אקריליק הכחולים שמשו כחיבור לאלקטרודות Ag / AgCl. ישנם ארבעה תאי תרבית תאים בשבב MDF. האזור והגובה של כל תא תרבית תאים הם 148 מ"מ 2 (3 × 46 מ"מ) ו0.07 מ"מ, בהתאמה. הערוצים הכחולים הקטנים בשכבות 3 ו -4 להתחבר לרשת גשר מלח לתאי התרבית. החתך של ערוצי קשר אלה הוא 0.25 מ"מ
תהליכי איור 2. MDF והרכבת ייצור שבבים. () הדפוסים של גיליון אקריליק והדבק דו צדדיים היו תוארו על ידי עיבוד לייזר CO 2. שכבות אקריליק בודדות (ב) גיליון היו מפוברקות על ידי לייזר CO 2 לפי ציור העיצוב. גיליון אקריליק ניקה (C)ים היו מלוכדים יחד באמצעות ונדר תרמית. (ד) שהושלמו הרכבה שבב MDF. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. מערכת לelectrotaxis מחקר. (א) תרשים סכמטי של המערכת לניסוי electrotaxis. הצינורות מחוברים לשבב MDF שמשו לעירוי בינוני וזרימת פסולת. DcEF בשבב נערך באמצעות אספקת אלקטרודות וכוח Ag / AgCl. התקנת המכשיר הותקנה על הבמה מנוע XYZ של מיקרוסקופ. תמונות תא בשבב נלקחו על ידי מצלמה SLR דיגיטלית מסחרית. (ארוחת בוקר) צילום של מרכיבי רשת הזרימה בינונית ודור dcEF במערכת microfluidic MDF, incluדינג מחבר הצינור (i), (ii) צינורות microcentrifuge-תחתית פתוחים, (iii) אגוז אצבע הדוקה לבן מוצק, (ד) אגוז אצבע צמודה צינור שקוף, ו( נ) אלקטרודות Ag / AgCl. נא ללחוץ כאן לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. השפעת Y27632 על נדידת תאי סרטן הריאות תחת EFS של () אפס ו( B) 300 גירוי mV / מ"מ. DcEF יושם לאחר טיפול מקדים שעה 1 עם הריכוז המצוין של Y27632. הגירוי החשמלי נמשך שעה 2. ניתוח כמותי של ההכוונה ולמהירות של נדידת תאי consititute ניסוי נציג. 90-100 בתאים ששימשו בניתוח הנתונים. * עבור P <0.001. הנתונים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית ההתקן שלהממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מצאנו את התהליך של הקפדה מתאמי אקריליק על שכבת 1 של שבב MDF להיות מסובך. היישום של רק 1 עד 2 μl של דבק סופר מספיק כדי לדבוק בנחישות את המתאם על שבב MDF. כמויות גדולות יותר של דבק הביאו פילמור שלם של הדבק ואי לדבוק סופר. ברגע שמתאמי אקריליק דבקו בחוזקה על שבב MDF, דליפת נוזל במערכת microfluidic התרחשה לעתים רחוקות. כמו כן, הדגירה O / N בתוך חדר הוואקום עזרה להוציא את מיזוג לכוד בין הקלטת דו צדדית / מכסה הזכוכית או ממשק גיליון הקלטת / אקריליק דו-צדדי. כתוצאה מכך, תהליך זה משפר את היציבות של תא התרבות בשבב MDF.
בקרת טמפרטורה של agarose 3% במהלך תקופת ההכנה של רשת גשר מלח היא חשובה. אם הטמפרטורה של agarose אינה גבוהה מספיק במהלך ההזרקה, agarose יהיה לגבש במהירות בתוך המזרק ולא יכוללהיות מוזרק לתוך רשת מלח הגשר. יתר על כן, במהלך הזרקת agarose, חשוב להימנע מכל היווצרות בועה ברשת גשר מלח. המראה של בועות מגדילות מאוד את ההתנגדות החשמלית של הרשת ומוביל לכישלון ניסוי. בנוסף, ברגע שagarose מתמצק במהלך ההזרקה, זה לא יכול לחסום לחלוטין את זרימת נוזל בערוץ גשר מלח. ככזה, הכימיקלים אז יכולים בקלות לדלוף לאפיקים אחרים. הגישה הטובה ביותר היא להזריק חם agarose לרשת ולאחר מכן לאפשר agarose כדי לחזק בתוך ערוצי גשר מלח.
הזרקת תא היא תהליך קריטי בניסוי electrotaxis. כדי להבטיח כמות מספקת של תאים לזריעת תאים בתא התרבות, אנו מזריקים מספר עודף של תאים. בגישה זו, תאים הוזרקו מהשקע. מהירות הזריקה צריכה להיות איטית ואפילו להימנע מהפצה סלולארי אחידה בתא התרבות. בנוסף, מכיוון שערוצים מבודדים בשבב MDF, ההזרקה חייב להיעשות ערוץ אחד בכל פעם. לכן, תהליך הזרקת תא המלא הוא זמן רב. בעתיד, יהיה צורך ליצור ערוץ הזרקת תאים נוסף שיכול תאים בו זמנית שתל לכל ארבעת תאי התרבות. תהליך חדש זה יקטין נפח דגימה, מספר התאים הדרושים להזרקה, וזמן פעולה.
ישנם מספר יתרונות בשימוש באקריליק ולא PDMS כפי שהחומר לבודת מכשיר microfluidic. מכשיר מבוסס אקריליק יכול להיות מופעל ישירות על תנור בלי חממה. מאז מערכת לא דורשת CO 2 אספקה, ניתן לגדל תאים בשבב ביו-מייקרו-הנוזלי מבוסס אקריליק על מיקרוסקופ הפוכה רגילה עם דוד. זה יותר קל להקליט תמונות תא בשבב מחוץ לחממה. אנחנו השתמשנו במצלמת SLR הדיגיטלית מסחרית זמינה באופן נרחב כדי להקליט את תמונות התא במערכת. בנוסף, רךכלי הכרחי לשליטה לתכנות של המצלמה הוא גם זמין בקלות. זה עושה את הזמן לשגות הדמיה של התאים בקלות לתכנות. לכן, העלות של בניית מערכת התמונה אוטומטית הקלטת יו-מייקרו-נוזלי היא נמוכה בהרבה מזה של מערכת מסחרית. לעומת זאת, בעת שימוש בשבב מבוסס PDMS, המערכת חייבת להיות מופעלת בחממה CO 2. לפיכך, ציוד הקלטת תמונה נוספת יש לרכוש לפעולה בחממה. ציוד כזה הוא יקר, יחסית מגושם, ותופס חלק גדול מהשטח המוגבל בתרבית תאי החממה. בהיבט אחר, בהשוואה לתהליך ייצור שבבי PDMS, הייצור קל ומהיר של מייקר אקריליק fl שבב uidic מתאים לשני אב טיפוס המכשיר וייצור. יתר על כן, בהשוואה למכשיר מבוסס PDMS, שבבי מייקרו-הנוזליים מבוסס אקריליק הוא מבני יציבים יותר ומתאים יותר לבניית מערכת microfluidic תלת-ממדית מורכבת רשת, כפי שהיההופיע עם שבב MDF במחקר זה. רשת גשר מלח על השבב בשבב MDF אינו יכולה להיות מיוצרת בקלות בהתקן מבוסס PDMS. מערכת רשת זו מקטינה את הגודל הכולל של שבב מייקרו-הנוזלי והופכת electrotaxis מחקר קל יותר ומהיר יותר.
בתוך שבב MDF, אנחנו שנוצרנו רק שתי נקודות חוזק חשמלי-שדה (EFS, 0 ו -300 mV / מ"מ) בכל ערוץ בודד. עם זאת, שבב MDF ושבב electrotactic הרב-שדה, כפי שדווח על ידי הואנג et al., 4 מניות עיצוב ערוץ דומה באזור תרבית תאים. על ידי שינוי הצורות של חדר התרבות בשבב MDF, יכול גם להיות שנוצר EFSs מרובה על שבב MDF. עם השינויים הללו, EFSs מרובה וכימיקלים מרובים ניתן להשתמש באותו המבחן. בהתאם ל, מערכת הקרנת תפוקה גבוהה יכולה להיווצר לחקור electrotaxis שימוש במכשיר.
רק ניסוי אחד, שבב MDF הוא מסוגל בודק את ההשפעות שלכימיקלים שונים על תאים תחת dcEF, או ההשפעות של גירוי חשמלי בסוגים שונים של תאים. זה יכול להיות אפילו אפשר ליישם 20 ערוצים מקבילים מבודדים בשבב MDF מבלי להגדיל את הגודל של המכשיר בצורה משמעותית. 8 כפי שהודגם בעבודה זו, בניסוי אחד, השגנו מתאם תלוי מינון משמעותי בין ההתכוונות של נדידת תאים ו Y27632 (איור 4). שבב MDF עם ארבעה ערוצים בבירור מספק גישה יעילה ללימוד electrotaxis בתאי סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24x60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M.
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
