Abstract
Opførslen af retningsbestemt cellemigration under en jævnstrøm elektrisk-felt (dcEF) omtales som electrotaxis. Den betydelige rolle fysiologisk dcEF vejlede celle bevægelse under udvikling embryo, celledifferentiering og sårheling er blevet påvist i mange undersøgelser. Ved at anvende mikrofluide chips til en electrotaxis assay, er undersøgelsen proces forkortes og eksperimentelle fejl minimeres. I de senere år mikrofluidenheder fremstillet af polymere stoffer (f.eks polymethylmethacrylat, PMMA eller acryl) eller polydimethylsiloxan (PDMS) er ofte blevet brugt til at studere reaktionerne af celler til elektrisk stimulation. Men i modsætning til de talrige trin, der kræves til at fremstille en PDMS enhed, den enkle og hurtige konstruktion af akryl mikro fl uidic chip gør den velegnet til både enheden prototyping og produktion. Men ingen af de rapporterede enheder letter effektiv undersøgelse af den samtidige kemiske og DCEF virkninger på celler. I denne rapport beskriver vi vores design og fremstilling af en acrylbaseret multikanal dual-elektrisk-felt (MDF) chip til at undersøge den samtidige effekt af kemiske og elektrisk stimulation på lunge- kræftceller. MDF-chip giver otte kombinationer af elektriske / kemiske stimulationer i en enkelt test. Chippen ikke blot i høj grad forkorter den nødvendige eksperimentelle tidspunkt, men øger også nøjagtighed i electrotaxis undersøgelser.
Introduction
Adfærd adhærente celler bevæger sig mod en anode eller katode under en jævnstrøm elektrisk felt (dcEF) omtales som electrotaxis. Den electrotactic adfærd celler spiller en væsentlig rolle i embryogenese, nerveregenerering og sårheling. 1 Tumorceller, såsom rotte prostatacancerceller, 2 brystcancerceller, 3 og lungeadenokarcinom celler 4-8 har vist electrotactic bevægelse under et påført dcEF . Den fysiologiske EF er målt i kirtel væv. 9,10 Electrotaxis er også blevet rapporteret i kirtel-associerede tumorceller. 2,3 Samlet set electrotaxis af kræftceller anses for at være en metastase faktor. 11 Styring af elektriske vejledning af cancerceller under dcEF kan være en potentiel strategi for den fremtidige behandling af cancer. Men i dag, den detaljerede molekylære mekanisme electrotaxis forbliver kontroversiel. Derfor er en undersøgelse af influence af elektrisk stimulation på kræft celle migration kan lette udviklingen af strategier for kræftbehandling.
For nylig har bio-mikrofluidenheder blevet fremstillet for at studere cellulære responser til at flyde forskydningskraft, 12 kemiske gradienter, 13 og elektriske stimuli 4 in vitro. Fremstilling af bio-mikrofluidenheder hjælp polydimethylsiloxan (PDMS) eller polymethylmethacrylat (PMMA, også kendt som acryl) har med succes reduceret fejlprocent med sådanne forsøg. Endvidere betyder anvendelsen af acrylbaserede mikrofluidenheder som en prototype til undersøgelse af biologiske emner er enklere end at bruge PDMS chips. Forskellige funktioner i acrylbaserede enheder er blevet udviklet til electrotaxis undersøgelse. Men ingen af de tidligere designs er i stand til samtidigt at teste effekterne af forskellige kemiske forhold og det elektriske felt på celler for electrotaxis undersøgelse. Således har vi udviklet en mikrofluidanordning-multichannel dobbelt elektrisk felt (MDF) chip-holdige fire uafhængige kanaler kultur og otte forskellige eksperimentelle betingelser i en chip.
Den acrylbaseret MDF-chip, først rapporteret af Hou et al., 8 integrerer elektrisk stimulation og flere kemisk isolerede kanaler. Disse kemisk isoleret kanaler kan anvendes til dyrkning forskellige typer af celler i et eksperiment. Den dcEF i kanalerne er produceret af en elektrisk strømforsyning. To uafhængige elektriske felter, et med anvendt elektrisk-feltstyrke (EFS), og en anden med 0 EFS, er i hvert kemisk isoleret kanal. På denne måde chippen giver bedre styret sameksisterende EF og kemisk stimulering. Endvidere resultater fra numerisk simulering af den kemiske diffusion inde i MDF chip angiver, at ingen krydskontaminering fandt sted mellem kanalerne efter en 24 timers forsøgsperiode. 8
I forhold til device rapporteret af Li et al., 14 MDF chip giver et større kulturområde, der giver mulighed for yderligere biokemisk analyse af de elektrisk stimulerede celler. Derudover, med MDF chip større observation område, flere celler kan observeres i testen, så analysen af migration hastighed eller rettethed af de elektrisk stimulerede celler er mere præcis. Single-channel chip design af tidligere undersøgelser rapporteret af Huang et al. 4 og Tsai et al. 15 tillader kun én celletype eller kemikalie, der skal testes. Imidlertid kan MDF chip anvendes til at undersøge virkningerne af forskellige kemikalier på electrotaxis, samt virkningerne af elektrisk stimulering på forskellige celletyper. Med andre ord, MDF chip muliggør effektiv undersøgelse af kemiske dosis afhængigheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design og fremstilling af MDF Chip
- Tegn en individuel akryl lag mønster ved hjælp af kommerciel software, såsom AutoCAD, og gemme mønsteret.
- Gennemgå udformningen af fire-lags akrylplade mønster i figur 1A og bekræfte inter-layer forbindelser.
- Fabrikere alle acrylplader og dobbeltklæbende tape med laser ablation hjælp af en CO 2 laser Ridsenål (figur 1B, 2A og 2B). 16
- Tænd for laseren Ridsenål og slutte maskinen til den kontrollerende laptop.
- Kør kommerciel software og åbn mønster designet i trin 1.1 ved at klikke på "designet mønster fil."
- Læg et stykke blankt akryl plader eller dobbeltklæbende tape på XYZ fase af laser Ridsenål.
- Indstille fokus af laserstrålen på overfladen af akryl plader eller dobbeltklæbende tape med en auto-alignment stick fra producenten af laseren Ridsenål.
- Sende designet mønster til laser Ridsenål til direkte bearbejdning af akryl plader eller dobbeltklæbende tape.
- Fjern det beskyttende papir fra acrylplader med pincet og blæse overfladen ren med nitrogen gas.
- Stable acrylplader og bond dem sammen under et tryk på 2 kg / cm2 i en termisk Bonder i 45 min ved 110 ° C til dannelse af flow / elektrisk stimulering kanal montering.
- Forbered mikroskop dækglas som celledyrkningssubstrat i chippen.
- Sæt dækslet glasset i en farvning krukke og fylde krukken med en ti-fold fortynding af de i materialet liste vaskemiddel.
- Sæt dækslet glas og farvning krukke i en ultralyds Steri-renere og rengøre dækglasset i 15 min.
- Hæld den fortyndede rengøringsmiddel ud af farvningen krukke, refill glasset med destilleret vand, og gentag trin 1.5.2 3 gange.
- Tør den rensede dækglas ved at blæse det med nitrogen gas, før klæbe den til den dobbeltklæbende tape.
- Overhold den rensede dækglas til strømmen / elektrisk stimulation kanal forsamling med den dobbeltklæbende tape mønstrede i trin 1.2.
- Overhold 13 stykker akryl adaptere til de enkelte åbninger i Lag 1 af MDF-chip forsamling med superlim. MDF chip montering derpå fuldstændig (figur 2D).
- Steriliser komplette MDF chip forsamling med 30 min på UV-bestråling før anvendelse.
2. Opsætning af Salt Bridge Netværk af MDF Chip
- Før brug sterilisere alle de plastrør, fingrene nødder og mikrocentrifugerør vist i figur 3B ved at fastsætte en holdetid på 15 minutter ved 121 ° C i autoklaven.
- Tilslut fluorplast rør (figur 3B-I) til MDF-chip forsamling via mediet indløbog outlet adaptere vist i figur 1A.
- Slut Luer konus af mediet indløb og udløb plastrør i figur 3B-I til 3-vejs stophaner.
- 2,5 ml af CO 2 -equilibrated phosphatbufret saltvand (PBS) under anvendelse af en 3 ml sprøjte og forbinde sprøjten med 3-vejs stophane af indløbet plastrør. Tilslut en tom 3 ml sprøjte til 3-vejs stophane af udløbet plastrør. De to sprøjter er således forbundet gennem MDF chip.
BEMÆRK: Inkubér PBS i 37 ° C 5% CO 2 cellekultur inkubator O / N at opnå CO2 -equilibrated PBS. - Forsegl åbningerne i blå og de grønne adaptere (figur 1A) på Lag 1 PMMA plader med hvide faste finger-stramme møtrikker (figur 3B-iii).
- Fyld salt bro kanaler og kultur kamre med CO 2 -equilibrated PBS i sprøjten beskrevet i opsætningen trin 2.4. Undgådannelsen af bobler.
- Dernæst satte CO 2 -equilibrated PBS-indeholdende MDF chip i 37 ° C 5% CO 2 cellekultur inkubator for O / N inkubation. Dette tillader den opløste luft i dobbeltsidede tape til dannelse af bobler i kamrene.
- Skylle boblerne i kanalerne ved en hurtig PBS flow i kanalen ved hjælp af to sprøjter. Pumpe PBS frem og tilbage om nødvendigt.
- Tøm PBS i kanalerne via 3-vejs stophane tilsluttet til mediet udløbsrøret.
- Ved hjælp af en ny 3 ml sprøjte, tage 2,5 ml CO 2 -equilibrated Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) (se trin 3.5), og erstatte sprøjten forbundet til indløbet med den nye. Refill kanalerne med mediet.
- Fremstilling af saltbroen netværket.
- Tidsmæssigt fjerne de faste møtrikker (Figur 3B-iii) på de grønne adaptere (figur 1A) og injicere 3% varmt (> 70 ° C) agarose i saltet briDGE kanal gennem åbningen i grønne adaptere (figur 1A).
BEMÆRK: Fremstilling af varmt agarose: Opløs 1,5 g agarose pulver i 50 ml PBS. Der steriliseres ved at fastsætte en holdetid på 20 minutter ved 121 ° C i autoklaven. - Stop injektion af agarose når væsken fylder tre fjerdedele af længden af saltbroen kanal.
- Forsegle porerne på de grønne adaptere (figur 1A) ved at skrue de faste møtrikker (figur 3B-III) efter agarose injektion.
- Erstatte de faste møtrikker på de blå adaptere (figur 1A) med gennemskinnelige rørformede fingrene møtrikker (figur 3B).
- Indlæse de 3% forvarmet agarose i de rørformede møtrikker (figur 3B-IV).
- Integrere Ag / AgCl elektroder (figur 3B-v) i de rørformede møtrikker (figur 3B-iv) førstørkning af agarosen.
- Tidsmæssigt fjerne de faste møtrikker (Figur 3B-iii) på de grønne adaptere (figur 1A) og injicere 3% varmt (> 70 ° C) agarose i saltet briDGE kanal gennem åbningen i grønne adaptere (figur 1A).
- Efter at have afsluttet opsætningen af saltbro netværket, injicere CL1-5 lungecancerceller i kulturen kamre, et kammer ad gangen.
3. Forberedelse af kræftceller og sat op til Electrotactic Experiment
- Regelmæssig kultur af lungekræft cellelinje CL1-5.
- Kultur de CL1-5 lungecancerceller, opnået fra Prof. Pan-Chyr Yang, 17 i det komplette medium i en 75T cellekultur kolben på 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. Det komplette medium er sammensat af DMEM og 10% føtalt bovint serum (FBS). Subkultur cellerne hver 3 til 4 dage. De celler, der anvendes til at udføre electrotaxis eksperimenter er mindre end 25 passager fra den oprindelige kilde.
- Tilsæt 2 ml 0,25% trypsin-buffer til de eksponentielt voksende celler CL1-5 og inkuberes i 2 min i 37 ° C 5% CO 2 cellekultur inkubator for celle detachment.
- Afslutte løsrivelse proces med 6 ml 10% FBS DMEM og centrifugeres cellerne ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter kasseres mediet og suspenderer cellebundfaldet med 5 ml PBS.
- Tæl antallet af celler i PBS. Derefter tage 1 x 10 6 celler og centrifugeres ved 300 g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Kassér PBS. Suspendere cellerne med forvarmet CO 2 -equilibrated DMEM og justere celledensiteten at være 1 x 10 6 celler / ml.
BEMÆRK: Inkubér det komplette medium i 37 ° C 5% CO 2 cellekultur inkubator O / N til opnåelse af CO 2 -equilibrated DMEM.
4. Opsætning for Electrotactic Experiment
- Fra udløbet af MDF chip injiceres 0,3 ml, 1 × 10 6 / ml, cellerne i chippen.
- Inkubér celle-seedede MDF chip i cellekultur inkubator (indstillet til 37 ° C og 5% CO2) i 2-4 timer.
- Opsætning af MDF mikrofluidsystem.
- Installer MDF mikrofluidsystem på en gennemsigtig indiumtinoxid glas (ITO) varmelegeme. Måle temperaturen på MDF chip med en K-typen termoelement klippet mellem MDF chip og ITO glas. Styr ITO varmelegeme med en proportional-integral-derivat (PID) controller. Indstil MDF mikrofluidsystem inkubationstemperatur til 37 ° C med PID-styreenheden.
BEMÆRK: fabrikation af ITO varmelegeme og opsætningen af cellekultur varmeanlægget er beskrevet i tidligere rapporter 18,19. - Monter temperaturstyret MDF chip forsamling på computerstyrede XYZ motoriseret etape på et omvendt mikroskop. Brugen af den motoriserede trin er beskrevet i trin 5.1. Pump det komplette medium i kulturen kamre gennem indløbene med en fire-kanals sprøjtepumpe.
- Installer MDF mikrofluidsystem på en gennemsigtig indiumtinoxid glas (ITO) varmelegeme. Måle temperaturen på MDF chip med en K-typen termoelement klippet mellem MDF chip og ITO glas. Styr ITO varmelegeme med en proportional-integral-derivat (PID) controller. Indstil MDF mikrofluidsystem inkubationstemperatur til 37 ° C med PID-styreenheden.
- Pump det komplette medium i MDF chip ved en flowhastighed på 20 ul / time. Kulturen affald fra udlader opsamles i mikrocentrifugerør (vist som "affald" i figur 3A).
- Inkubér cellerne i anden 16-18 timer ved 37 ° C i MDF chip.
- For at udskifte mediet, pumpe mediet indeholdende 50, 25, 5 og 0 pM-inhibitor, henholdsvis i hver kultur kammeret ved en strømningshastighed på 20 ul / min i 10 minutter.
BEMÆRK: Der fremstilles en 10 mM stamopløsning af Rho-associeret proteinkinaseinhibitoren Y27632 ved tilsætning 3 ml sterilt vand til 10,6 mg kinase inhibitor. 10 mM stamopløsning fortyndes til 50, 25 og 5 uM, henholdsvis anvendelse af 10% FBS DMEM-medium. - Inkubér cellerne i kinase-inhibitor til en anden 60 minutter ved 37 ° C. Indstil medium strømningshastighed til 20 pi / time. Brug den samme kultur temperatur og strømningshastighed beskrevet ovenfor i senere trin.
- Brug elektriske ledninger til at tilslutte en DC strømforsyning til MDF chippen via Ag / AgCl elektroder på chippen.
- Serielt tilslutte et amperemeter in det elektriske kredsløb. Brug amperemeteret at overvåge den elektriske strøm i MDF chip.
- Tænd for DC strømforsyning og sætte amperemeteret strøm til 86,94 uA ved at justere forsyningsspændingen til mellem 15 og 19 V.
BEMÆRK: I betragtning af Ohms lov, E = I / (σA EFF), hvor I er den elektriske strøm, der strømmer gennem bulkmaterialet, dvs. dyrkningsmediet i electrotactic kammer, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) er ledningsevne af dyrkningsmediet, Aeff (= 0,21 mm 2 for en 3 mm bredde × 0,07 mm højde) er den effektive tværsnitsareal af electrotactic kammer, og den elektriske strøm (I), der kræves for at generere et 300 mV / mm EF i MDF chip er 86,94 uA.
5. Køb og Analyse af Cell billeder
- Styr motoriserede scenen ved hjælp af et Matlab GUI-program. Med MDF mikrofluidsystem monteret på microscope, flytte chippen til observation områder med den motoriserede scenen.
- Optag celle billeder ved hjælp af et digitalt spejlreflekskamera (SLR) monteret på mikroskopet.
- Tag mikroskopiske billeder ved hjælp af en 4X objektiv med intervaller på 15 min i 2 timer.
- Cellemigration analyse.
- Kør NIH ImageJ 1,47 V.
- Analyser afstanden fra den oprindelige til det endelige positioner af cellens tyngdepunkt.
- Gå til "Filer" → "Import" → "Image Sequence", og importere ni billeder til cellemigration analyse. Det første billede er et resultat af tiden nul, og det sidste billede er resultatet af 120 min.
- Gå til "Analyze" → "Set Målinger", og marker feltet ud for "Centroid"
- Klik på "Freehand Selections" ikonet.
- Skildrer kanten af de markerede celler i det første billede.
- Gå til "Rediger" → "Selection" → "Tilføj til Manager"
- Gå til niende billedet og skildrer kanten af de samme celler udvalgt på det første billede. Cellen positioner kan spores ved hjælp af den anden til ottende billeder.
- Gå til "Rediger" → "Selection" → "Tilføj til Manager"
- Gentag trin 5.4.5 til 5.4.9 for at indsamle data fra 90 til 100 celler.
- Gå til "Analyze" → "Mål" for at få resultatet af de indledende og afsluttende stillinger af de markerede celler.
BEMÆRK: migration hastighed defineres som den gennemsnitlige længde cellebevægelse pr time. Den rettethed defineres som cosinus, hvor er vinklen mellem vektoren af dcEF (fra anode til katode) og vektoren fra udgangspunktet af en celle til sin endelige position. Den rettethed er -1 for celler migrerer mod anoden og +1 for celler migrerer mod katoden. For en gruppe af tilfældigt mirivning celler, den rettethed er 0. 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fabrikation og samling af MDF-enhed
Et skematisk diagram af acrylbaserede MDF chip er vist i figur 1A. Fire acrylplader, et dækglas 13 akryl adaptere, og et stykke dobbeltklæbende tape blev anvendt i konstruktionen af den færdige MDF chip (figur 2D). Der er kun fire uafhængige kanaler kultur i MDF enheden. Men den on-chip saltbro netværk skaber otte forskellige eksperimentelle betingelser i de otte segmenter af chippen. Tre saltbroer (de blå kanaler i Lag 2 i figur 1A), 79, 90 og 80 mm i længden, blev koblet til det andet lag af MDF chip uden at forstyrre billedet observation. De små porer (blå kasseformet kanaler i lag 3 og 4 i figur 1A) mellem saltbroen nettet og kultur kamre, som har en 0.25 Mm2 tværsnit, minimeres fluidumhastigheden i saltbro under eksperimentet. Kulturen område af MDF chip er omkring 74 mm 2 i hvert segment. I denne demonstration er cellekultur kamre i MDF-enheden består af 70 um tyk dobbeltsidet tape og dækglas. Men hvis andre celle dyrkningsbetingelser (f.eks et kollagen belægning krav, lav flow shear, eller stor dyrkningsmedium volumen i kulturen kammer) er nødvendige for electrotaxis forskning, både kultur substrater og båndene let kunne udskiftes. Derfor kan forskellige typer af celler anvendes til electrotaxis undersøgelse i MDF chip.
Konfiguration af MDF mikrofluidsystem
MDF mikrofluidsystem setup er illustreret i figur 3A. De i figur 3B komponenter er used at etablere mediestrøm og den elektriske strøm netværk i MDF mikrofluidsystem. Rørene er forbundet med de hule finger-stramme møtrikkerne (rød og grøn) og Luer vokslys (brun) i figur 3B-i er vant til at transportere medium til MDF flow-netværket. Efter sprøjterne var tilsluttet luer tilspidses og afvikles på fire kanaler pumpe, var rørledningsstrømningen systemet fuldstændig. Dyrkningsmedium og affald transporteres gennem rørledningen systemet. Fordi forbindelsen mellem rørene og akryl adaptere er fastgjort med skruet stik, kan MDF medium netværket tolerere højere hydrauliske tryk, end der kan PDMS systemet. På grund af den ekstremt lave luftpermeabilitet af acrylplader og rørene, er enhver kontakt mellem mediet netværket og de ydre omgivelser blokeret. Derfor pH-værdien af mediet i systemet forbliver stabilt, og cellerne kan dyrkes ved hjælp af MDF mikrofluidsystem uden for en CO2-inkubator. Da MDF lmIP er installeret på en motoriseret trin kan time-lapse celle billeder tages fra otte individuelle sektioner. De åbne bund mikrocentrifugerør (figur 3B-II) er monteret på gennemskinnelige rørformede finger-stramme møtrikker (figur 3B-iv) for at øge lydstyrken kapacitet agarose. På denne måde kan relativt store elektroder indsættes i agarose at tilvejebringe stabile elektrisk stimulation til cellerne i længere perioder.
Generering af angivet jævnstrøm elektrisk felt i MDF chip
Spændingen på hvert kammer kan måles via implanterede elektroder i det elektriske kredsløb tilsluttet chip. Men havde vi ikke måle spændingen i kammeret. Snarere, vi simulerede det elektriske felt i saltbroen netværket og cellekultur kamre chippen. Fire electrotactic kamre var serielt coneven- tuel i de elektriske kredsløb. På denne måde er den samme elektriske strøm opretholdes i hvert af disse kamre. Ifølge Ohms lov, EFS korrelerer med arealet af tværsnittet af kamrene i mikrofluidapparatet. Derudover blev alle PMMA plader og bånd fremstillet af CO 2 laser Ridsenål. Tilpasningen af de chip montage stykker er præcis og de strukturelle fejl i chippen er minimale. Således bør de EFS i hvert kammer forblive stabil. Det elektriske felt simulering resultater viser en homogen fordeling af EFS med 300 og 0 mV / mm i de første halvdele og de resterende halvdele af kulturen kamre i enheden (data ikke vist). Tidligere rapporter fra vores laboratorium, Huang et al. og Tsai et al., har vist, at forskellen i de målte og de simulerede EFS værdier var mindre end 4%. 4,15 Dette resultat viser, at i vores system, den målte elektriske felt svarer godt til den simulerede værdi. I denne vægtORK, vi indsatte store Ag / AgCl elektroder til at levere stabil elektrisk strøm til en langvarig eksperiment. Den anvendte strøm på MDF chippen kun faldt 1,85 ± 0,19% efter 7 timer af EF-stimulering i electrotaxis eksperimenter. Desuden den længste periode med elektrisk stimulering var 4 timer i vores studie. Således mener vi input elektrisk strøm forbliver stabil under electrotaxis test og det elektriske felt i electrotactic kamre i MDF-chip overvåges af serielt tilsluttet amperemeter.
Undersøgelse af electrotaxis for lungekræft celler ved anvendelse af MDF mikrofluidsystem
Den electrotactic regulering af Rho-associeret coiled-coil-kinase (ROCK) er blevet påvist i ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO), 20 endothelial, 21 og neuronale celler 22, men er endnu ikke blevet undersøgt for lungekræft calen. Derfor ROCK inhibitor, Y27632, blev påført på MDF mikrofluidsystem at studere dens virkning på electrotaxis af lungecancerceller. Som vist i figur 4, behandling af Y27632 viste ingen effekt på ændring af cellemigrering hastighed med eller uden elektrisk stimulering. Men anvendelsen af Y27632 for cancerceller under dcEF (300 mV / mm) signifikant reduceret deres anodisk migration. Ved 50-uM koncentrationen, ROCK-hæmmer elimineret anodisk bevægelse af lungekræft celler, men påvirkede ikke deres migration hastighed. Desuden var der en dosisafhængig sammenhæng mellem de anvendte kemiske koncentrationer og rettethed indeks (figur 4B). Disse resultater antyder, at MDF mikrofluidsystem er pålidelig og effektiv til at studere electrotaxis.
Figur 1. DesIGN af MDF chip. (A) Skematisk tegning af MDF chip. MDF-enheden består af fire lag acrylplader (72 × 50 mm), 13 akryl adaptere (10 × 10 × 6 mm), dobbeltsidede tape og et dækglas (24 × 60 mm). Tykkelsen af laget 2 akrylplade er 2 mm, og de tre andre lag hver er 1 mm. I de lavere tre akryl lag, er salt broen og mellemstore flow netværk repræsenteret ved de blå og røde blokke hhv. I den første akrylplade lag blev grønne akryl adaptere der anvendes til injektion af agarose. Blå akryl adaptere blev anvendt som forbindelsen til Ag / AgCl elektroder. Der er fire cellekultur kamre i MDF chip. Området og højden af hver cellekulturkammerets er 148 mm 2 (3 x 46 mm) og 0,07 mm. De små blå kanaler på Lag 3 og 4 forbinde salt bro netværk til kultur kamre. Tværsnittet af disse forbindelseskanaler er 0,25 mm
Figur 2. MDF chip fabrikation og montage processer. (A) De mønstre af akryl plader og dobbeltklæbende tape blev beskrevet af CO2-laser bearbejdning. (B) De enkelte akrylplade lag blev fabrikeret af en CO 2 laser i henhold til design tegning. (C) Den rensede acrylplades blev bundet sammen ved hjælp af en termisk Bonder. (D) Afsluttet MDF-chip forsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. System til electrotaxis undersøgelse. (A) Skematisk diagram over systemet til electrotaxis eksperiment. Rørene er forbundet med MDF chip blev anvendt til medium infusion og affald efflux. Den dcEF i chippen blev gennemført gennem Ag / AgCl elektroder og strømforsyning. Opsætningen enhed blev installeret på XYZ motor fase af et mikroskop. Cell billeder i chippen blev taget af et kommercielt digitalt SLR-kamera. (B) Fotografi af komponenterne i det medium flow-netværket og dcEF generation i MDF mikrofluidsystem, inkluding (i) rør-stik, (ii) åben bund mikrocentrifugerør, (iii) hvidt fast fingrene møtrik, (iv) gennemskinnelige rørformet finger-stramme møtrik, og (v) Ag / AgCl elektroder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Virkning af Y27632 om lungekræft cellemigrering under EFS (A) nul og (B) 300 mV / mm. DcEF stimulering blev påført efter 1 times forbehandling med den angivne koncentration af Y27632. Den elektriske stimulation varede i 2 timer. Den kvantitative analyse af rettethed og hastigheden af cellemigrering consititute et repræsentativt eksperiment. 90-100 celler blev anvendt i dataanalyse. * for P <0,001. Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelsemiddelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi fandt processen med vedhængende akryl adaptere på Lag 1 af MDF chip til at være en vanskelig opgave. Anvendelsen af kun 1 til 2 pi superlim er tilstrækkelig til at klæbe fast adapteren på MDF chip. Større mængder af lim resulterede i en ufuldstændig polymerisation af superlim og manglende overholdelse. Når acryl adaptorer klæbet fast på MDF chip, væskelækage i mikrofluidsystem sjældent forekom. Desuden O / N inkubation i vakuumkammeret bidraget til at fjerne luften fanget mellem dobbeltklæbende tape / dækglas eller dobbeltklæbende tape / akrylplade interface. Følgelig denne proces forøger stabiliteten af kulturen kammer i MDF chip.
Temperaturstyring af 3% agarose under fremstillingen af saltbroen netværket er vigtig. Hvis temperaturen af agarose ikke er høj nok under injektionen, vil agarosen hurtigt størkner inden i sprøjten og ikke kaninjiceres i saltbroen netværket. Desuden under agarose injektion, er det vigtigt at undgå enhver bobledannelse i saltbroen netværket. Fremkomsten af bobler øger den elektriske modstand af nettet og fører til eksperimentel fejl. Desuden når agarose størkner under injektionen, kan det ikke fuldstændigt blokere væskestrømmen i saltbroen kanal. Som sådan kan de kemikalier derefter let sive ind andre kanaler. Den bedste fremgangsmåde er at injicere varm agarose i netværket og derefter lade agarose at størkne inde i salt bro kanaler.
Celleinjektion er en kritisk proces i electrotaxis eksperimentet. For at sikre et tilstrækkeligt antal celler til cellepodning i kulturen kammeret injicerede vi stigningen i antallet af celler. I denne tilgang blev cellerne injiceret ud af stikkontakten. Injektionen hastigheden bør være langsom og jævnt for at undgå en ujævn cellefordeling i kulturen kammeret. Hertil kommer, fordi dekanaler er isoleret i MDF chip, skal injektionen udføres én kanal ad gangen. Således komplette celleinjektion proces er tidskrævende. I fremtiden vil det være nødvendigt at oprette en ekstra celle injektion kanal, der kan samtidigt implantat celler i alle fire kultur kamre. Denne nye fremgangsmåde vil reducere prøvevolumenet, antallet af celler, der kræves til injektion, og driftstiden.
Der er flere fordele ved at anvende akryl i stedet PDMS som materiale til fremstilling af mikrofluidapparatet. En acryl-baseret enhed kan betjenes direkte på et varmelegeme uden en kuvøse. Da systemet kræver ingen CO 2 forsyning kan celler dyrkes i et acrylbaseret bio-mikrofluid chip på en regelmæssig inverteret mikroskop med varmelegemet. Det er lettere at optage celle billeder i chippen uden for en inkubator. Vi anvendte en alment tilgængelig kommercielt digitalt SLR-kamera til at optage billeder celle i systemet. Hertil kommer, at blødeware nødvendigt for programmerbar styring af kameraet er også let tilgængelige. Dette gør time-lapse billeddannelse af cellerne let programmerbar. Derfor omkostningerne ved at bygge bio-mikrofluid auto-optagelse billedet system er meget lavere end for et kommercielt system. I modsætning hertil, når du bruger en PDMS-baserede chip, systemet skal drives i en CO2-inkubator. Således må ekstra billede kontrolapparater købes for drift i inkubatoren. Sådant udstyr er dyrt, relativt voluminøse og optager en stor del af den begrænsede plads i cellekultur inkubator. I et andet aspekt i forhold til processen med PDMS chip fabrikation, den nemme og hurtige fremstilling af akryl mikro fl uidic chip er velegnet til både enheden prototyping og produktion. Desuden forhold til PDMS-baserede enhed, acrylbaseret mikrofluid chip er strukturelt mere stabilt og egnet til at konstruere en kompliceret tredimensionalt mikrofluidsystem netværkssystem, som varudføres med MDF chip i denne undersøgelse. Den on-chip saltbro netværk i MDF chip ikke let kan fremstilles i en PDMS-baseret enhed. Dette netværk minimerer den samlede størrelse af mikrofluid chip og gør electrotaxis forskning lettere og hurtigere.
Inde i MDF-chip, vi genererede kun to elektriske feltstyrker (EFS, 0 og 300 mV / mm) i hver isoleret kanal. Men MDF chip og multi-felt electrotactic chip, som rapporteret af Huang et al., 4 deler et tilsvarende kanal design i cellekultur regionen. Ved at ændre formen af kulturen kammer i MDF chip, kan flere EFSs også genereres på MDF chip. Med disse ændringer, kan multiple EFSs og flere kemikalier anvendes i samme test. Følgelig kunne skabes et højkapacitetsscreening system til at undersøge electrotaxis bruger enheden.
På kun et eksperiment, MDF chip er i stand til at teste virkningerne afforskellige kemikalier på celler under dcEF, eller påvirkninger af elektrisk stimulering på forskellige typer af celler. Det kan endda være muligt at gennemføre 20 isolerede parallelle kanaler i MDF chip uden væsentlig forøgelse af størrelsen af indretningen. 8 Som vist i dette arbejde, i et eksperiment, har vi opnået en betydelig dosisafhængig sammenhæng mellem rettethed af cellevandring og Y27632 (figur 4). MDF chip med fire kanaler giver klart en effektiv tilgang til at studere electrotaxis i kræftceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24x60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M.
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
