Abstract
Vi etablerade ett endodermalt epitel cellodlingsmodell (EEG) för att studera funktionen hos vissa enzymer och proteiner i medla näringsutnyttjande av fågelembryon under utveckling. Befruktade japanska vakte inkuberades vid 37 ° C under 5 dagar och sedan gulesäcken membran (YSM) uppsamlades för att fastställa EEG odlingssystemet. Vi isolerade den embryonala endodermet skiktet från YSM, och skivade membranet in 2 - 3 mm bitar och digererades partiellt med kollagenas före ympning i 24-brunnars odlingsplattor. EECS prolifererar ut ur vävnaden och är redo för cellodlingsstudier. Vi fann att EECS hade typiska kännetecknen för YSM in vivo, till exempel ackumulering av lipid droppar, uttryck av sterol O-acyltransferas och lipoproteinlipas. Den partiella uppslutning behandlingen signifikant ökad framgångsrik graden av EEG kultur. Med hjälp av den EECS visade vi att uttrycket av SOAT1 reglerades av cAMP dependent proteinkinas A relaterad reaktionsvägen. Denna primära japansk vaktel EEG odlingssystemet är ett användbart verktyg för att studera embryonala lipid transport och klargöra vilken roll gener som är involverade i förmedling näringsutnyttjande i YSM under fågel embryonal utveckling.
Introduction
Den största närings resurs aviär embryot är äggula, som består av 33% lipider, 17% protein och 1% aska. 1 under fosterutvecklingen, gulesäcken membran (YSM) växer inifrån embryonala bukhålan och gradvis täcker äggula yta. Med början vid embryonal dag 2, genuttryck i samband med lipidmetabolism och angiogenes successivt ökat i YSM och YSM utvecklas långsamt villus liknande utsprång. 8,9 Dessa prognoser ökar absorptionen av äggula näringsämnen för att stödja embryonal utveckling. Den YSM är en extraembryonic vävnad som innehåller tre groddblad, endoderm, mesoderm och ektoderm. 14 gulesäcken ektoderm ansikten äggvitan och länkar med vitellinmembranet att försiktigt täcka gulesäcken. De endodermala epitelceller står inför direkt mot äggula och fungera som näringsutnyttjande portaler. 6 Som YSM expanderar endodermalt epitelceller (EECS) kan delas med shape och funktionalitet i två grupper, område vitelline och området vasculosa. 7
Område vitelline består av endodermala celler och är avlägsen från embryot; område vasculosa består av mesodermala celler och omfattar differentierade eec med blodkärl och bindväv. Genom embryonala dag 5, är äggulan helt täckt av ektoderm och endoderm av YSM och kärlområdet har vuxit snabbt. Den YSM absorberar, omdisponeras och frigör lipider (som äggula härrörande mycket låg densitet lipoprotein) och proteiner i den embryonala cirkulationssystemet. 9, 2 Därför har vi etablerat en primär japansk vaktel embryonala endodermalt epitelial cellkultursystem, för att studera mekanismerna för lipid utnyttjande i YSM under fågel embryonal utveckling.
Lipider såsom triacylglycerol, lecitin, fosfolipider och kolesterolester (CE) är de primära energikällor för fågelembryon. På de tidiga stadierna av utveckling, äggula lipider är composed endast 1,3% CE och det stiger till 10-15% efter halva tiden av avian embryonal utveckling 3, är 11. Kolesterol ester syntetiseras från kolesterol av sterol O-acyltransferas en (SOAT1) i fågelembryo YSM. 4
Lagringsformen av kolesterol är CE är CE transporteras i lipoproteiner och lipoproteiner transporteras genom cirkulationen till vävnaderna. 13 En vecka före lucka finns snabba tillväxten av fågelembryon. Cirka 68% av de återstående fettinnehållet i äggula absorberas under detta skede. 10 Den mekanism genom vilken äggula lipider används kan klargöras genom ett EEG forskningsmodell. En kyckling EEG odlingsprotokoll bildades för att uppnå denna forskning mål. 2, 9 Men på grund av den låga andelen framgångsrika vävnadsexplantat, ett förbättrat EEG cellodlingsförfarande behövs för att studera funktionen av vissa enzymer och proteiner vid medienäringsutnyttjande genom fågelembryon under utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta förfarande är en modifiering av en kyckling modell kultur protokoll som utvecklats av et al Bauer 2013 och Nakazawa et al, 2011. 2,9..
1. Förbered Friska embryonala dag 5 embryon från japansk vaktel
- Placera en hane och tre kvinnliga könsmogna japansk vaktel tillsammans i samma bur. Tillförsel foder och vatten ad libitum. Justera ljuset i djurrummet till 14 h ljus och 10 h mörker.
- Samla befruktade ägg i plastpåsar varje dag på eftermiddagen och hålla dem i en 16 ° C kylskåp för att fördröja tillväxten av embryon.
- Efter uppsamling av ett tillräckligt antal ägg inom en två veckors period, inkubera de befruktade äggen i en 37 ° C inkubator med god ventilation under fem dagar.
2. Förbered Basal Medium och tvättlösningar
- Använd DMEM / F-12-medium (justerad till pH 7,2) som tillväxtmediet, och komplettera denmed 10% serum från nyfödd kalv (NBCS) och 1% Pen-Strep amfo. Lösning (PSA; Penicillin, 10 5 enheter / L; streptomycin, 100 mg / L; amfotericin B, 0,25 mg / L).
- Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning vid en 10x koncentration för förvaring; Använd 1x PBS-lösning (innehållande NaCl, 137,93 mM, KCl, 2,667 mM, KH 2 PO 4, 1.471 mM, Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM, justera till pH 7,2) för att tvätta och fukta gulesäcken membranet medan separera endoderm från äggula och albumin.
- Använda DMEM-medium (justerad till pH 7,2) för att återsuspendera endoderm pellets.
3. Insamling av primär EECS från japansk vaktel YSMs
- Inkubera de uppsamlade ägg under 5 dagar (steg 1,3). Undersök äggen av ett ägg candler att bekräfta normal embryonal utveckling.
OBS: På embryonala dag 5, är gränsen för YSM mesoderm mycket tydlig och 3 embryonala skikten mindre tätt sammanlänkade, så det är lätt att obtain endoderm. Använd endast ägg som uppvisar normal kapillärcirkulationen utveckling för YSM samlingar. - Rengör äggskal noga med rent vatten och 75% etanol. Öppna äggskal från luftcellen position genom en sax, försiktigt dra ut och samla hela YSM av pincett och lägg i en 10 cm odlingsskål fylld med 37 ° C 1x PBS.
- Med hjälp av en sax bort embryot, äggula och äggvita och försiktigt tvätta YSM med 1x PBS tre gånger och placera YSM i PBS-lösning i en 10 cm odlingsskål.
- Använd pincett och en sax för att ta bort ektoderm från YSM. Använd 2 pincett, en att stadigt hålla endodermalt cellskiktet, och den andra för att hålla kapillär mesoderm.
- Under ett dissektionsmikroskop, dra isär och separera endoderm från kanten av mesoderm i riktning mot embryot. Uppsamla det ljusgul endoderm i 50 ml centrifugrör med användning av en pipett och placera i 15 ml tillväxtmedium i en 37 ° C water bad tills alla vävnadssamlingar är klara.
4. Digestion av endoderm skivor genom kollagenasdigerering
- Färskt upplösa 6,5 enheter av typ IV-kollagenas i 10 ml DMEM.
- Centrifugera 50 ml rör (3,4) vid 130 xg i 3 min vid RT. Aspirera mediet och placera all endoderm i en 6 cm odlingsskål med en pipett. Tillsätt 1 ml kollagenas lösning på detta odlingsskål.
- Skiva endoderm samlats in från 2 vaktel embryon med ett par böjd sax tills storleken på varje skiva är ungefär 2 till 3 mm. Använd en pipett, samla alla skivor i en 50 ml centrifugrör tillsammans med 9 ml färsk kollagenaslösning.
- Smälta den vävnad med kollagenas under 30 min i en 37 ° C skakande vattenbad vid 175 rpm. Denna partiella digerering med kollagenas används för att förbättra explantatet cellproliferation.
- Centrifugera vid 130 xg under 3 min vid RT och försiktigt bort supernatantfraktionen med hjälp av en pipett. Tvätta pelleten genom suspension i 20 ml DMEM och avlägsna supernatanten fraktionen efter 130 xg centrifugering under 3 min.
- Återsuspendera pelleten med 12 ml tillväxtmedium (DMEM / F12 med 10% NBCS och 1% PSA) och utsäde försiktigt och lika in i en 24-brunnsplatta (varje brunn med 500 ^ il cell lösning).
- Inkubera vävnadsexplantat vid 37 ° C i 5% CO2 i luft under 2 dagar för att tillåta cellerna att föröka sig ut ur vävnaderna.
- Inkubera cellerna i ytterligare 2 dagar och karakterisera för cellviabiliteten med en cellviabilitet analysprotokoll. 15
NOT: Living celler upprätthålla en reducerande miljö i cytosolen. Resazurin, den aktiva ingrediensen, är en icke-toxisk, cellpermeabla förening som är blå i färgen och praktiskt taget icke-fluorescerande. När läggs till cellkulturer, är resazurin reducerad till resorufin i cytosolen av mitokondriella enzymer. Resorufin är röd till färgen och mycket fluorescerande. Viabla celler omvandlar kontinuerligt resazurin till resorufin, steg omAsing den totala fluorescensen och färg av odlingsmediet som omger cellerna. - Utför endoderm epitelceller total RNA isolering, omvänd transkription och kvantitativ realtids-PCR av markörgen-mRNA-expression såsom beskrivits. 16,17
- Använda omvänt transkriptas-PCR för att detektera SOAT1 mRNA (sense: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisense: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR-produkt = 168 bp) som en specifik markör för EEG celler. Använd β-aktin mRNA (sense: 5'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 ', antisense: 5'GTGATGGACTCTGGTGATGG-3', PCR-produkt = 151 bp) som en housekeepinggen och intern kontroll.
- Använd gelelektrofores för att upptäcka produktens storlek av RT-qPCR. Framställ 1% agarosgel, och blanda 10 | il qPCR produkten med 2 | il laddningsfärg. Belastning 10 | il blandning i varje brunn i 1% agarosgel, och kör gelén genom 100V i 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att uppnå målet att skapa en konsekvent och användbar cellmodell, måste vi utvidga och stabilisera spridningen hastigheten och prestanda fågel eec. Vi jämförde direkt inkubation av endoderm utan någon enzymdigerering med endoderm partiellt med proteolytiska enzymer, såsom kollagenas eller kollagenas plus 0,6 U av dispas. Dispas är en amino-endopeptidas som hydrolyserar N-terminala peptidbindningar icke-polära aminosyrarester. Medan proteasdigestion behandlingar ökad celltillväxt jämfört med ingen nedbrytning (Figur 1), var celltillväxt inte skiljer sig markant mellan de två enzymbehandlingar efter fem dagars inkubation (Figur 2). Men resulterade kollagenas behandling i en bättre tillväxtkurvan och visade att EECS frodats stadigt för 6-9 dagar (Figur 2). Således förbättrade partiell kollagenasdigerering tillväxten av EECS frånex-vivo explantat och rekommenderas för att få tillräcklig och funktionell EEG.
Efter 4 dagars inkubering, EECS hade en adipocyt-liknande utseende detekteras efter formalinfixering och Oil-Red O-färgning (figur 3), vilket antyder korrekta fysiologiska egenskaperna hos de odlade cellerna.
Vi antog att cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) är en transkriptionsreglerande medel, varvid cAMP-fosfodiesterashämmare, 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX; för att minska nedbrytning av cAMP) och adenylcyklas aktivator, forskolin (för att öka syntesen av cAMP) både stimulerad SOAT1 mRNA-uttryck efter 24 timmar behandling (Figur 4). Dessa behandlingar ökade också uttrycket av SREBP2, en kolesterolsyntes reglerande transkriptionsfaktor, och forskolin förbättrade uttrycket av perilipin-2 (PLIN2), ytan proteinmarkör of lipiddropparna (Figur 5). EEG-mRNA profiler för lipogen gener kvantifieras genom realtids-PCR liknar adipocyter (Figur 5).
Figur 1. Effekt av Partiell kollagenasdigestion på endodermalt epitelceller. Vävnads explantat inkuberades under 2 dagar för att tillåta cellerna att proliferera ut ur vävnaden. Vi observerade och beräknade numren på de framgångsrikt odlas EECS. Siffror beräknades för celler utan matsmältningen och celler partiellt med kollagenas; båda odlades i 24-brunnsplattor. Y-axeln är väl antalet framgångsrikt prolifererade eec i cellodlingsplatta med 24 brunnar. Data presenterades som medelvärden ± SEM. Analys bestämdes genom parat t-test. P <0,0001. Klicka häratt se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cell Growth Utförande av EECS efter partiell Enzymdigestion. Den proliferationshastighet detekterades genom cellviabilitet analys. Analysen innehöll resazurin, en blå förening som har svag fluorescens och resazurin reduceras till resorufin vid inträdet celler. Livsdugliga celler omvandlar kontinuerligt resazurin till resorufin, vilket ökar den totala fluorescens och färgen på media omgivande celler. Viabla celler detekterades genom absorbans vid 570 nm med normalisering vid 600 nm. Data presenterades som medelvärden ± SEM. Analys bestämdes genom två-vägs ANOVA med Bonferroni post-test (kollagenas grupp n = 10; kollagenas + dispas grupp n = 11). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. Vänligen click här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. morfologi Cultured EECS. Efter 4 dagars inkubation, EECS hade en fettceller liknande utseende upptäcktes efter formalinfixering och olje Red O färgning. Från vänster till höger: EEG: s i ljusa fält med 100 gångers förstoring i ljusa fält med 200 gångers förstoring och i 200 gångers förstoring efter färgning med Oil-röd O och hematoxylin. Den mörka fläck på vänster längst till vänster siffran är den delvis smälta endoderm (membran). Skala stapel representerar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. SOAT1 Transcription av eec Behandlade med cAMP Aktivatorer. Vi behandlade EECS med ökande koncentrationer av IBMX eller forskolin vid dag 5 under 24 timmar. Vi extraherade mRNA från behandlade celler och omvandlas RNA till cDNA genom omvänd transkription PCR. Vi analyserade transkriptionsnivåer av realtids kvantitativ PCR. β-aktin användes som housekeeping-genen. Data presenterades som medelvärden ± SEM. Analyser var genom en-vägs ANOVA med Tukeys post-test (n = 6) (* P≤ 0,05, ** P≤ 0,01). IBMX är en konkurrenskraftig icke-selektiva fosfodiesterashämmare som höjer intracellulära cAMP aktiverar PKA, hämmar TNF-alfa och leukotrien syntes, minskar inflammation och medfödd immunitet och är en icke-selektiva adenosin-receptorantagonist. Forskolin är en allestädes närvarande aktivator av eukaryot adenylylcyklas, som vanligen används för att höja nivåerna av cAMP. Klicka här för att se en större version av denna Figure.
Figur 5. mRNA uttryck av EEG odlas i fem dagar, behandlades sedan med cAMP aktivatorer för 24 h. CDNA i Figur 4 användes för att analysera genuttryck nivåer genom realtids kvantitativ PCR. β-aktin användes som housekeeping-genen och tjänade som intern kontroll. Data presenterades som medelvärden ± SEM. Analyser var genom en-vägs ANOVA med Tukeys post-test (n≤ 6) för att jämföra behandlingar med kontrollen. SREBP2, srebp 2; LPL, lipoproteinlipas; PLIN2, perilipin-2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom den tidigare odlingssystemet har endast begränsad framgång, behövs ett bättre kultursystem. Den japanska vaktel YSM endoderm kräver behandling med proteolytiska enzymer såsom kollagenas att lossa cellcellkontakter för att uppnå bättre tillväxt i ex-vivo explantat. Våra data visar att cellantal från partiell digestion behandling var större än från osmält vävnadsodling efter sådd under 2 dagar (Figur 1). Därför är den partiella proteolytisk digestion ett kritiskt steg för att förbättra cellutbytet från YSM.
Den kritiska ändring i den aktuella kulturen protokollet är den partiella proteolytisk matsmältning. Denna behandling förbättras avsevärt cellutbytet och den framgångsrika hastigheten för att erhålla levande eec. Uppslutningstiden är mycket kritisk eftersom över matsmältningen kommer att separera celler från vävnader och celler kommer inte fästa till plattan, medan under matsmältning resulterat i mindre cellutbyte frånvävnadsexplantat. Vi fann att 30 till 40 min spjälkning med användning av de betingelser som beskrivits ovan är optimal.
Det nuvarande protokollet kräver hög teknisk utbildning för att få EECS. Tidpunkten för insamling EECS är begränsad, till exempel bara vi samlar EECS på embryonala dag 5. Anledningen är att eftersom fågelembryon växa, anslutningarna mellan skikten i gulesäcken membran är mer komplexa och den minskar den framgångsrika hastighet av uppsamling EECS. Protokollet kan användas för att erhålla eec av embryon i tidiga skeden, men inte embryon sent skede. Det begränsar möjligheten till direkt forskning på det sena stadiet EECS.
Uttrycket av SOAT1 och lipoproteinlipas, och lipidackumulering är viktiga egenskaper hos YSM 4,5,11, särskilt EECS. I den aktuella studien, SOAT1, LPL, och perilipin 2 (PLN2) mRNA uttrycktes starkt i EECS, vilket tyder på odlingssystemet kan generera celler med den korrekta fysiologiska characteristics. Den nuvarande tekniken produceras en stor mängd primära eec. När vi använde tidigare beskrivna proceduren 9, andelen framgångsrika EEG kulturen var ca 60% i cellodlingsplattor av 24 brunnar, medan det nuvarande protokollet genererade EECS till nästan 100% framgång.
Gulesäcken membranet är den huvudsakliga vävnad att absorbera proteiner, lipider och kolesterol från äggula, vilket fungerar för att överföra näringsämnen från äggulan till embryon under utveckling. Den huvudsakliga enzymet för kolesterolesterbildning är SOAT1. 11 Eftersom SOAT1 ökar dramatiskt i sena stadier av aviär embryonal utveckling när massiv kolesterol förestring sker fyra använde vi SOAT1 mRNA uttryck som markörgen för att utvärdera egenskaperna hos odlade eec. Vi visade att denna primära EEG odlingssystem produceras förväntade fysiologiska egenskaper. Därför kan EEG odlingssystemet vara ett värdefullt verktyg för att studera Embryonenic lipid transport och klargöra vilken roll gener som är involverade i förmedling näringsutnyttjande i YSM under fågel embryonal utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Medel för utveckling av nuvarande protokollet är särskilt stöds av "sikta mot toppen University Plan" av National Taiwan University, Taiwan (bidrag ID-104R350144), samt ministeriet för vetenskap och teknik i Taiwan (bidrag ID: MOST 104 -2313-B-002-039-My3). Vi tackar särskilt Center for Biotechnology av National Taiwan University för att ge ett djur rum och laboratorielokaler för den aktuella studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
