Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen

Summary

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Abstract

Intracerebrale parenchymale arteriolen (PA's), die parenchymale arteriolen, indringende arteriolen en pre-capillaire arteriolen omvatten, zijn hoge weerstand bloedvaten vertakking van pial slagaders en arteriolen en duiken in de hersenen parenchym. Individuele PA perfuseren een discrete cilindrische grondgebied van het parenchym en de neuronen in ons systeem. Deze arteriolen zijn een centrale speler in de regulatie van de cerebrale doorbloeding zowel wereldwijd (cerebrovasculaire autoregulatie) en lokaal (functionele hyperemie). PA's maken deel uit van de neurovasculaire eenheid, een structuur die overeenkomt doorbloeding metabole activiteit in de hersenen en ook neuronen, interneuronen en astrocyten. Perfusie met PA is direct gekoppeld aan de activiteit van neuronen in dat gebied en een toename van neuronale metabolisme leiden tot een verhoging in lokale perfusie veroorzaakt door dilatatie van de voeding PA. Regulatie van PA verschilt van die beter gekarakteriseerdepiale slagaders. -Druk-geïnduceerde vaatvernauwing is groter in de Pas en vaatverwijdende mechanismen variëren. Daarnaast hebben PA niet extrinsieke innervatie ontvangen van perivasculaire zenuwen - innervatie is intrinsieke en indirect in de natuur door contact met astrocytische uiteinde. Dus, gegevens met betrekking tot contractiele regulering opgebouwd door studies met pial slagaders niet direct te vertalen naar het begrijpen van PA-functie. Verder blijft onbepaald hoe pathologische toestanden, zoals hypertensie en diabetes, beïnvloeden PA structuur en reactiviteit. Deze leemte is deels het gevolg van de technische problemen in verband met PA isolatie en canule. In dit manuscript presenteren we een protocol voor isolatie en infusen van knaagdieren PA's. Verder tonen we voorbeelden van experimenten die zijn uitgevoerd met deze arteriolen, waaronder agonist veroorzaakte vernauwing en myogene reactiviteit. Hoewel de focus van dit manuscript is op de PA infusen en de druk myography, geïsoleerde PAB kan ook worden gebruikt voor biochemische, biofysische, moleculaire en beeldvormende studies.

Introduction

De cerebrale circulatie is uniek georganiseerd om de metabolische behoeften van centrale neuronen, cellen die energieopslag beperkte en daardoor zeer gevoelig voor veranderingen in de zuurstofspanning en aanvoer van noodzakelijke voedingsstoffen ondersteunen. De bijzondere neuronale subpopulaties actief wordt wanneer specifieke taken worden uitgevoerd, het vaatstelsel bevordert een sterk gelokaliseerde toename van perfusie plaatselijke hypoxie en uitputting van voedingsstoffen ¹ voorkomen. Dit is een vorm van functionele hyperemie bekend als neurovasculaire koppeling, en is afhankelijk van de goede werking van de neurovasculaire eenheid, bestaande....

Protocol

1. canule en de Kamer Voorbereiding

1. Plaats schoon borosilicaatglas capillairen (buitendiameter: 1,2 mm, binnendiameter: 0,69 mm, 10 mm lang) in de groeven van een pipet trekker met een platina draad (diameter: 100 pm).
2. Met behulp van de juiste instellingen, trek de capillaire om een canule met een lange en dunne tip (figuur 2) met behulp van een micropipet trekker te genereren. De gebruikte instellingen zijn: Heat - 700, Pull - 100, Velocity - 50, - 10.
3. Steek canule in de houder van de druk myograaf kamer. Lijn de canules gepast.
4. breken voorzichtig de uiteinden van de canules door een tang onder de dissectiemi....

Results

Figuur 5A toont een representatief vernauwing van muis PA 60 mM KCl aCSF om de integriteit van het preparaat te evalueren. PA moet vernauwen tussen 15-30% in aanwezigheid van 60 mM KCl. Als de vernauwing is dan 15%, gooi de PA canule en andere, zoals wordt gesuggereerd dat de arteriole werd beschadigd tijdens het isoleren en canule proces.

Figuur 5B illustreert PA vernauwing aan toenemende con.......

Discussion

Cerebral parenchymale arteriolen zijn hoge weerstand arteriolen met weinig anastomoses en takken die verschillende neuronale populaties perfuseren. Deze gespecialiseerde bloedvaten centrale spelers in cerebrovasculaire autoregulatie en neurovasculaire koppeling through-astrocyten gemedieerde vaatverwijding ^1. Het belang van deze gespecialiseerde bloedvaten in cerebrale vasculaire ziekte is gekend voor ongeveer 50 jaar, toen het pionierswerk van Dr. Miller Fisher beschreven structurele veranderingen in parench.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl Anhydrous	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope	Olympus	SZX7
Super Fine Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter	VWR Scientific	28145-477
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Dark Green Nylon Thread	Living Systems Instrumentation	THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS-200
Video Dimension Analyzer	Living Systems Instrumentation	VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
Heating Unit	Warner Instruments	64-0102
Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B