Este manuscrito describe un protocolo simple y reproducible para el aislamiento de arteriolas intracerebrales (un grupo de vasos sanguíneos que abarcan arteriolas parenquimatosas, arteriolas penetrantes y arteriolas precapilares) de ratones, para ser utilizado en miografía a presión, inmunofluorescencia, bioquímica y estudios moleculares.
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Artículo de método
El aislamiento y la canulación del parénquima cerebral arteriolas
En este artículo
Resumen
Resumen
arteriolas del parénquima intracerebrales (AP), que incluyen las arteriolas, arteriolas penetrantes del parénquima y arteriolas pre-capilares, vasos sanguíneos son de alta resistencia que ramifican hacia fuera de las arterias y arteriolas pial y el buceo en el parénquima cerebral. PA individual perfundir un territorio cilíndrica discreta del parénquima y las neuronas que contiene. Estas arteriolas son un actor central en la regulación del flujo sanguíneo cerebral tanto a nivel mundial (autorregulación cerebrovascular) y local (hiperemia funcional). AP son parte de la unidad neurovascular, una estructura que coincide con el flujo de sangre regional a la actividad metabólica en el cerebro y también incluye neuronas, interneuronas, y astrocitos. La perfusión a través de las AP está directamente relacionada con la actividad de las neuronas en ese territorio particular, y el aumento de plomo metabolismo neuronal a un aumento en la perfusión de la zona por la dilatación de la alimentación de PA. Reglamento de las AP difiere de la de mejor caracterizadopial arterias. vasoconstricción inducida por presión es mayor en las áreas protegidas y los mecanismos vasodilatadores varían. Además, las áreas protegidas no reciben inervación extrínseca de los nervios perivasculares - inervación es intrínseca e indirecta en la naturaleza a través del contacto con los pies terminales astrocíticos. Por lo tanto, los datos relativos a la regulación contráctil acumulados por los estudios que utilizan arterias pial no se traduce directamente a la comprensión de la función PA. Además, sigue sin determinarse cómo los estados patológicos, como la hipertensión y la diabetes, afectan a la estructura y reactividad PA. Esta brecha de conocimiento es en parte consecuencia de las dificultades técnicas relacionadas con el aislamiento de PA y la canalización. En este manuscrito se presenta un protocolo para el aislamiento y la canalización de las AP de roedores. Además, se muestran ejemplos de experimentos que se pueden realizar con estas arteriolas, incluyendo constricción inducida por el agonista y reactividad miogénica. Aunque el objetivo de este manuscrito es el PA canulación y myography presión, aislado PAs también se puede utilizar para estudios bioquímicos, biofísicos, moleculares y de imagen.
Introducción
La circulación cerebral se organiza única para apoyar las demandas metabólicas de las neuronas centrales, las células que han limitado las reservas de energía y en consecuencia son muy sensibles a los cambios en la presión de oxígeno y el suministro de nutrientes necesarios. Como determinadas subpoblaciones neuronales se vuelve activo cuando se realizan tareas específicas, la vasculatura promueve un aumento muy localizada en la perfusión para evitar la hipoxia local y el agotamiento de los nutrientes 1. Esta es una forma de hiperemia funcional conocido como acoplamiento neurovascular, y depende de la operación correcta de la unidad neurovascular, ....
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Protocolo
1. cánula y cámara de preparación de
- Inserte capilares de vidrio de borosilicato limpia (diámetro exterior: 1,2 mm; diámetro interior: 0,69 mm; 10 mm de longitud) en las ranuras de un extractor de pipeta con un filamento de platino (diámetro: 100 micras).
- Utilización de las configuraciones adecuadas, tire del capilar para generar una cánula con una punta larga y delgada (Figura 2) utilizando un extractor de micropipeta. Los ajustes que se utilizan son: Heat - 700, Pull - 100, velocidad - 50, Tiempo - 10.
- Insertar la cánula en el soporte de la cámara de myograph presión. Alinear las cánulas apropiadamente.
- romp....
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Resultados
La Figura 5A muestra una constricción representante de las AP de ratón a 60 mM KCl LCRa para evaluar la integridad de la preparación. AP debe constreñir entre 15 - 30% en presencia de KCl 60 mM. Si el estrechamiento es inferior al 15%, desechar la AP y cannulate otro, ya que sugiere que la arteriola fue dañado durante el proceso de aislamiento y la canalización.
La Figura 5B ilustra PA constri.......
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Discusión
arteriolas del parénquima cerebral son las arteriolas de alta resistencia con pocas anastomosis y ramas que irrigan distintas poblaciones neuronales. Estos vasos sanguíneos especializados son actores centrales en la autorregulación cerebrovascular y acoplamiento neurovascular a través de la vasodilatación mediada por astrocito-1. La importancia de estos vasos sanguíneos especializados en la enfermedad vascular cerebral se conoce desde hace aproximadamente 50 años, cuando el trabajo pionero del Dr. Miller Fish.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Financiado por NHLBI R01HL091905 (SE), la beca de investigación CADASIL de la Fundación Unida de Leucodistrofia (FD) y AHA 15POST247200 (PWP). Los autores desean agradecer a Samantha P. Ahchay por proporcionar la imagen en la Figura 1, y al Dr. Gerry Herrera, Ph.D., por proporcionar comentarios críticos sobre el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Líquido cefalorraquídeo artificial | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhidro | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Aislamiento/Canulación | |||
| Microscopio estereoscópico | Olympus | SZX7 | |
| Pinzas súper finas | Herramientas de ciencia fina | 11252-00 | |
| Tijeras de resorte Vannas | Herramientas de ciencia fina | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μ l | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μ m Filtro de jeringa estéril | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Extractor de micropipetas | Sutter Instruments | P-97 | |
| Vidrio de borosilicato Diámetro exterior: 1,2 mm, diámetro interior: 0,68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Hilo de nailon verde oscuro | Sistemas vivos Instrumentación | THR-G | |
| Alineación lineal Sistemas vivos de cámara de un solo recipiente | Instrumentación | CH-1-LIN | |
| Servocontrolador de presión con bomba peristáltica Instrumentación | Living Systems | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Instrumentación de Living Systems | VDA-10 | |
| Grabadora de cuatro canales con LabScribe 3 Software de grabación y análisis Instrumentación | Living Systems DAQ-IWORX-404 | ||
| Unidad | de calefacciónWarner Instruments | 64-0102 | |
| Controlador de temperatura automático | Warner Instruments | TC-324B |
Referencias
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Al....
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Reimpresiones y permisos
