Abstract
Mikrofluidenheder er i stand til at skabe en præcis og styrbar cellulære mikromiljø af pH, temperatur, saltkoncentration og andre fysiske eller kemiske stimuli. De er blevet almindeligt anvendt til in vitro celle-studier ved at tilvejebringe in vivo som omgivelserne. Især hvordan celler respons til kemiske gradienter, elektriske felter, og spændinger shear har trukket mange interesser, eftersom disse fænomener er vigtige i forståelsen cellulære egenskaber og funktioner. Disse mikrofluide chips kan være fremstillet af glassubstrater, silicium wafers, polydimethylsiloxan (PDMS) polymerer, polymethylmethacrylat (PMMA) substrater, eller polyethylenterephthalat (PET) substrater. Ud af disse materialer, PMMA substrater er billige og kan let bearbejdes ved hjælp af laser ablation og skrivning. Selv om et par mikrofluidenheder er designet og fremstillet til at generere flere, sameksisterende kemiske og elektriske stimuli, blev ingen af dem betragteseffektiv nok til at reducere eksperimentelle gentagelser, især til screeningsformål. I denne rapport beskriver vi vores design og fabrikation af to PMMA-baserede mikrofluide chips til at undersøge cellulære reaktioner, i produktionen af reaktive ilt arter og migration, under en enkelt eller sameksisterende kemiske / elektriske / shear stress stimuli. Den første chip genererer fem relative koncentrationer på 0, 1/8, 1/2, 7/8 og 1 i kulturen regioner, sammen med en forskydningsspænding gradient produceret i hvert af disse områder. Den anden chip genererer de samme relative koncentrationer, men med fem forskellige elektriske feltstyrker oprettet inden hver kultur-området. Disse anordninger ikke kun give celler med en præcis, kontrollerbar mikromiljø men også i høj grad øge den eksperimentelle gennemløb.
Introduction
In vivo-celler er omgivet af en række forskellige biomolekyler herunder ekstracellulære matrix (ECM), carbohydrater, lipider og andre celler. De funktionalisere ved at reagere på mikro-miljø stimuli såsom vekselvirkninger med ECM og svar på kemiske gradienter af forskellige vækstfaktorer. Traditionelt er in vitro celle undersøgelser udført i celle dyrkningsskåle hvor forbruget af celler og reagenser er stort og celler vokser i en statisk (ikke-cirkulerende) miljø. For nylig har mikro-fabrikerede enheder integreret med fluidkomponenterne forudsat en alternativ platform for celle studier i en mere kontrollerbar måde. Sådanne indretninger er i stand til at skabe en præcis mikromiljø af kemiske og fysiske stimuli og samtidig minimere forbruget af celler og reagenser. Disse mikrofluide chips kan være fremstillet af glassubstrater, silicium wafers, polydimethylsiloxan (PDMS) polymerer, polymethylmethacrylat (PMMA) substrater, eller polyethyleneterephthalat (PET) substrater 1-3. PDMS-baserede enheder er gennemsigtige, biokompatible, og permeabel for gasser, hvilket gør dem egnede til langvarig cellekultur og undersøgelser. PMMA og PET substrater er billig og let at blive bearbejdet ved hjælp af laser ablation og skrivning.
Mikrofluidenheder bør give celler med en stabil og kontrollerbar mikro-miljø, hvor cellerne er underlagt forskellige kemiske og fysiske stimuli. For eksempel er mikrofluide chips anvendes til at studere kemotaksi af celler. I stedet for traditionelle metoder, der beskæftiger Boyden kammer og kapillar 4,5 disse miniaturiserede fluide enheder kan generere præcise kemiske gradienter for at studere cellernes adfærd 1,6,7. Et andet eksempel er at studere cellernes retningsbestemt migration under elektriske felter EFS (), et fænomen opkaldt electrotaxis. Electrotactic adfærd af celler blev rapporteret at være relateret til nerve regenerering 8, fosterudvikling 9,og sårheling 10,11. Og mange undersøgelser er blevet udført for at undersøge electrotaxis af forskellige celletyper, herunder kræftceller 12,13, lymfocytter 14,15, leukæmi celler 11, og stamceller 16. Konventionelt petriskåle, og dækglas anvendes til at konstruere electrotactic kamre til generering elementærfiler 17. Sådanne simple opsætninger give problemer medium fordampning og upræcise elementærfiler, men de kan overvindes ved mikrofluidenheder af lukkede, veldefinerede fluide kanaler 12,18,19.
At systematisk studere cellulære responser under præcise, kontrollerbare kemiske og elektriske stimuli, ville det være til stor nytte for at udvikle mikrofluidenheder kan levere celler med flere stimuli på samme tid. For eksempel Li et al. rapporterede en PDMS-baserede mikrofluidanordning for at skabe en enkelt eller sameksisterende kemiske gradienter og elementærfiler 20. Kao et al. devstak en lignende mikrofluid chip til at modulere kemotaksi af lungekræft celler ved elementærfiler 6. Endvidere at øge throughput, Hou et al. designet og fabrikeret en PMMA-baserede multikanal-dual-elektrisk-felt chip til at give celler med 8 forskellige kombinerede stimuli, bliver (2 EFs styrker x 4 kemiske koncentrationer) 21. For yderligere at øge hele og tilføje forskydningsspændingen stimulus, vi udviklet to PMMA-baserede mikrofluidenheder til undersøgelse cellulære reaktioner under enkelt- eller sameksisterende kemiske / elektriske / shear stress stimuli.
Rapporteret af Lo et al. 22,23, disse enheder indeholder fem uafhængige cellekultur-kanaler er underlagt kontinuerlig fluidisk flyder, efterligner in vivo kredsløbssygdomme. I den første chip (den kemisk-forskydningsspænding chip eller CSS chip), fem relative koncentrationer af 0, 1/8, 1/2, 7/8 og 1 frembringes i kulturen regioner, og en forskydningsspænding gradient er produced inde i hver af de fem kulturområder. I den anden chip (den kemisk-elektriske felt chip eller CEF chip), ved hjælp af et enkelt sæt af elektroder og 2 sprøjtepumper, er fem ELEMENTÆRFILEN styrker genereret ud over fem forskellige kemiske koncentrationer inden disse kulturområder. Numeriske beregninger og simuleringer udføres for at bedre design og drive disse chips, og lungekræft celler dyrket inde i disse indretninger er genstand for enkelt- eller samtidig eksisterende stimuli til observation deres svar med hensyn til produktion af reaktive oxygenarter (ROS), vandringshastigheden, og migrationen retning. Disse chips er vist sig at være tidsbesparende, high-throughput og pålidelige enheder for at undersøge, hvordan cellerne reagerer på forskellige mikro-miljømæssige stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip Design og Fabrication
- Draw mønstre skal poleres på PMMA substrater og dobbelt-side tape anvender kommerciel software 24.
- At undersøge virkningerne af kemiske koncentrationer og forskydningsspændinger, tegne en "juletræ" mønster med en varierende bredde ved sin ende i hvert af de fem kultur områder (figur 1A og 1B).
- At undersøge virkningerne af kemiske koncentrationer og elektriske felter, tegne en "juletræ" mønster med to flere fluide kanaler til saltbroer (figur 2a og 2b).
- Scribe en individuel mønster på en PMMA ark eller en dobbelt-side tape ved at indlæse den tilsvarende fil i CO 2 laser SCRIBER.
- Tænd laseren SCRIBER, og kontrollere dens forbindelse til computeren. Åbn mønster, der skal ablateres ved hjælp af kommerciel software.
- Placer et PMMA ark eller et bånd o dobbeltsidetn toppen af fase af SCRIBER. Juster fokus på CO 2 laseren om nødvendigt ved hjælp af kalibrering bar og det synlige He-Ne laser.
- Indlæse mønster i SCRIBER for ablation på PMMA arket eller båndet.
- Saml den mønstrede ark eller tape, fjerne uønskede stykker, og rengør overfladen med nitrogen blæser.
BEMÆRK: Tykkelsen af PMMA plader er 1 mm, og den for dobbeltklæbende tape er 0,07 mm eller 0,22 mm.
2. Chip Assembly
- Med superlim, vedhæfte akryl adaptere (x bredde x længde højde = 10 mm x 10 mm x 5 mm, med gevind i midten) til den øverste lag af chippen ved at justere gevind og hullerne på toppen -De fleste lag. Disse adaptere tjener som medium indløb / udløb og salt bridge stik.
- Saml mikrofluid chip inde i en laminær strømning.
- Saml den kemisk-forskydningsspænding mikrofluid chip (CSS chip).
- ENttach 3 ark ridsede PMMA plader ved hjælp af 2 stykker beskrevet dobbeltklæbende tape. (Figur 1A og 1B).
- Tilføje endnu stykke af 0,07 mm tyk dobbeltsidet tape til bunden af chippen og fastgør chippen til en 10 cm diameter petriskål.
- Sæt samlingen chip i vakuumkammeret natten over.
- For at samle den kemisk-elektriske felt chip (CEF chip), fastgør PMMA plader til en dobbeltklæbende tape tykkelse = 0,22 mm (figur 2A og 2B).
- Fastgør den ridsede PMMA plader og dobbeltsidede tape til en 10 cm diameter petriskål ved hjælp af denne samme stykke tape.
- Lad den samlede chip inde i hætten og udsætte den for UV i 30 min til sterilisering.
- Slut indgangene til to 3-ml sprøjter via plastrør og finger-stramme nødder. Tilslut udløbet til et spild rør via et plastrør og en finger-stram møtrik.
BEMÆRK: Autoklavealle rør og møtrikker ved 121 ° C i 15 minutter før brug. - Langsomt trykkes stemplet på sprøjten til prime de strømningstekniske kanaler med PBS. Push sprøjter frem og tilbage for at fjerne bobler.
- Sætte chips inde i en inkubator natten over ved 37 ° C under 5% CO2.
BEMÆRK: Disse to trin har til formål at vaske chip og fjerne eventuelle resterende bobler inden chippen. - Tag chippen ud af inkubatoren.
- Forbered agar salt broer til at generere elektriske felter i CEF chip.
- Opløs 3% agarose med lavt smeltepunkt i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) buffer under anvendelse af en mikrobølgeovn.
- Sprøjt løsningsorienteret faset agarose ind i salt bro kanal og indsætte elektroderne før løsning størkner.
- Placer sølv / sølv-klorid elektroder i de rørformede nødder.
- Slut sprøjterne til sprøjtepumper, og strømme kontinuerligt dyrkningsmediet (Dulbeccos Modified EagleR17; s medium, DMEM) ind i strømningstekniske kanal i 10 minutter ved en flowhastighed på 20 pl / min for at erstatte PBS.
3. Cell Forberedelse og forsøgsopstilling
BEMÆRK: Pre-varm 1x PBS, dyrkningsmedium (DMEM plus FBS), og trypsin i et 37 ° C vandbad før brug.
- Plade 2 x 10 5 lungekræft CL1-5 celler 25,26 i en 10 cm petriskål leveres med DMEM plus 10% føtalt bovint serum (FBS). Inkubér cellerne inde i en inkubator under 5% CO2 ved 37 ° C, indtil 90% konfluens.
- Aspirer medium og vask cellerne en gang med forvarmet 1x PBS. Tilsæt 2 ml 0,05% trypsin buffer til cellerne og vente på 2 til 3 minutter ved 37 ° C for at løsne cellerne.
- Overfør cellerne til et 15 ml sterilt centrifugerør, og der tilsættes 6 ml dyrkningsmedium ind i røret. Vend forsigtigt reagensglasset til blanding og tag 5 pi af celleholdige medium til tælling af celleantal i et hemocytometer.
- Centrifugeres røret ved 300 x g i 5 min. Suspender 10 6 celler i 1 ml dyrkningsmedium og placere celleholdige medium i en 1 ml sprøjte.
- Indgyde cellen medium til mikrofluid chip ud af stikkontakten, og sørg for, at den løsning, distribuerer alle gennem de fem kulturområder. Inkubér chippen inde i en inkubator under 5% CO2 ved 37 ° C i 2 timer.
4. Eksperimentel opsætning
- Tag chippen ud af kuvøsen og placere den på toppen af en transparent indiumtinoxid (ITO) glas varmelegeme.
BEMÆRK: ITO glas er forbundet med en proportional-integral-derivat (PID) controller til opretholdelse af temperaturen ved 37 ± 0,5 ° C via feedback fra en termisk kobling klemt stramt mellem ITO varmelegeme og chippen. - Sætte chip-varmeaggregat oven på en motoriseret XY-scene af et omvendt mikroskop til sporing cellemigrering eller en fast XY-scene afen omvendt fluorescerende mikroskop til måling af produktionen af ROS.
- Til at generere forskellige kemiske koncentrationer, fylde to sprøjter med 5 ml af kemiske opløsninger af relative koncentrationer 0 og 1 (opløst i dyrkningsmedium) og pumpe dem ind i chippen ved ønskede strømningshastigheder: i CSS chippen, ved en strømningshastighed på 0,3 ml / min i 1 time; i CEF chippen, ved en flowhastighed på 20 ul / min i de første 20 min og en strømningshastighed på 20 gl / time i en anden 120 min (total tid = 2 timer).
- I CEF chip, til sporing af celle migration, program XY etape af mikroskop for at gentage tage billeder, via en digital spejlreflekskamera (DSLR) kamera, af visse felt af synspunkter (FOVs) inden kulturområder hver 15 min til 2 time.
- Til måling af produktionen af ROS, bruge fluorescens-baserede indikator 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetat (2'-7'-DCFDA).
- Forbered bestanden af 2'-7'-DCFDA ved 10 mM i molekylær biologi klasse dimethylsulfoxid (DMSO). Fortynd DCFDA i DMEM kun uden serum (5 uM i DMEM). Den potentielle deacetylase kan øge baggrundssignaler og mindske de signaler i celler.
- Efter 1 time af shear stress stimulus i CSS chip eller efter 2 timer af EF stimulus i CEF chip, pumpe 2'-7'-DCFDA (5 uM i DMEM) i chippen ved en flowhastighed på 20 ul / min i de første 20 min og en strømningshastighed på 20 gl / time i yderligere 20 minutter. Til vask, pumpe DMEM i chippen ved en flowhastighed på 20 ul / time i 20 minutter.
- Tag billeder, via en afgift-coupled device (CCD) kamera, af visse FOVs inden kulturområder for at analysere de fluorescerende intensiteter.
5. Beregninger af kemiske Koncentrationer, forskydningsspændinger, og elektriske felter
- I både CSS chip og CEF chip, beregne de kemiske koncentrationer i de fem kultur områder. For eksempel ved at indsprøjte H 2 O 2 af concentrtioner 0 og 200 uM fra de to indløb, koncentrationer på 0, 25, 100, 175, og 200 uM genereres.
BEMÆRK: Ved at antage, at alle væsker split-flow glat og lige rundt om gaflen, de relative koncentrationer i de fem kulturområder er 0, 1/8, 1/2, 7/8 og 1 hhv. - I CSS chip, beregne forskydningsspændingen (τ) i hver af kultursupernatanterne områder ved hjælp
27, hvor Q er volumenstrømmen, η er fluidik viskositet, h er højden af kanalen, og w er bredden af kanalen.
BEMÆRK: Ved at sætte Q = 0,3 ml / min i hvert indløb (Q = 0,12 ml / min i hver kultur-området), η = 0,0008 Pa · s for dyrkningsmedium, h = 1 mm, og w = 1 ~ 4 mm, den forskydningsspænding beregnes til at ligge i området fra 0,0048 Pa (4 mm bred område) til 0,0192 Pa (1 mm brede område). - ICEF chip, beregne EF styrke inden for hver af de kulturområder bruger E = I / (σA eff) (Ohms lov), hvor jeg er den elektriske strøm, der går på tværs af strømningstekniske kanal, σ er den elektriske ledningsevne af dyrkningsmediet, og Aeff er den effektive tværsnitsareal af kanalen.
BEMÆRK: Brug af σ = 1,38 Ω -1 m -1 for dyrkningsmedium og Aeff = 0,22 mm2 (width = 1 mm og højde = 0,22 mm), er EF styrken beregnes til at være E (mV / mm) = I ( A) × 3,3 × 10 6.- Som vist i figur 2D, behandle det ækvivalente kredsløb som fem C-sektion kredsløb med fire (8 + 35 + 8) segmenter og en (5 + 35 + 5) segment.
BEMÆRK: Ved at analysere denne parallelle kredsløb ifølge Kirchhoffs spænding lov og Ohms lov, strømme, der løber på tværs af fem kultur ersom, jeg 1 til I 5 fra bund til top, er beregnet til at være omkring 0,49 I (område 1), 0,25 I (område 2), 0,13 I (område 3), 0,08 I (område 4), og 0,05 I (område 5) henholdsvis hvor i er den samlede jævnstrøm (DC). Med en påført dc af 0,157 mA, elementærfiler på 254, 130, 67, 41, og 26 mV / mm genereres inden for de fem kultur områder.
BEMÆRK: For en forenklet elektrisk analyse af mikrofluid netværk er alle strømningstekniske segmenter betragtet som modstande med resistens proportional med deres længder.
- Som vist i figur 2D, behandle det ækvivalente kredsløb som fem C-sektion kredsløb med fire (8 + 35 + 8) segmenter og en (5 + 35 + 5) segment.
27, hvor Q er volumenstrømmen, η er fluidik viskositet, h er højden af kanalen, og w er bredden af kanalen. 6. Data Analysis
Bemærk: Dataanalyse udføres ved anvendelse af ImageJ software.
- Analyser Produktion af ROS.
- Kør ImageJ software. Gå til "Filer" → Åbn for at indlæse en fluorescerende billede, der skal analyseres.
- Gå til "Image" → "Type" → "16-bit" for at ændre imalder at en grå skala.
- Tegn en polygon til at vedlægge en celle. Gå til "Analyser" → "Mål" for at måle den gennemsnitlige fluorescerende intensitet af cellen.
- Gentag 6.1.3 at indsamle intensiteter fra mindst 50 celler af tre uafhængige forsøg, og beregne det gennemsnitlige intensitet med standardfejl på middelværdien (SEM).
- Gentag 6.1.1-6.1.4 for hver eksperimentel betingelse.
- Analyser Cell Migration.
- Kør ImageJ software. Gå til "Filer" → Åbn for at indlæse et billede taget ved tid = 0, der skal analyseres.
- Tegn en polygon til at vedlægge en celle. Gå til "Analyser" → "Mål" for at måle tyngdepunktet af cellen som (x 1, y 1).
- Gentag 6.2.1- 6.2.2 at måle tyngdepunktet af den samme celle som (x 2, y 2) fra et andet billede tages ved tid = t.
- Beregn migration sats (i um / time) afdenne celle som
. - Gentag 6.2.1-6.2.4 at indsamle vandringshastigheder fra mindst 50 celler af tre uafhængige forsøg, og beregne det gennemsnitlige vandringshastigheden med standardfejl på middelværdien (SEM).
- Fra 6.2.2 og 6.2.3, beregne migration rettethed af denne celle som cosinus θ eller
, Hvor θ er vinklen mellem vektoren af den påførte EF (fra positiv til negativ) og vektoren fra starten til slutningen position af cellen (fig 2G). - Gentag 6.2.6 at indsamle migration rettethed fra mindst 50 celler af tre uafhængige forsøg, og beregne det gennemsnitlige migration rettethed med standardfejl på middelværdien (SEM).
- Beregn den gennemsnitlige migration sats med SEM og den gennemsnitlige migration rettethed med SEM for hver eksperimentel betingelse.
BEMÆRK: En rettethedaf en angiver, at alle celler migrerer mod katoden, og en -1 værdi indikerer, at alle celler migrerer mod anoden. Det rettethed af en gruppe af tilfældigt bevægelige celler er tæt på 0.
- Analyser Cell Justering.
- Kør ImageJ software. Gå til "Filer" → "Åbn" for at indlæse et billede, der skal analyseres.
- Behandl cellen som en ellipse og trække en linje til at angive den lange akse af en celle. Gå til "Analyze" → "Mål" for at måle vinklen β mellem linje og den vandrette EF retning.
- Gentag 6.3.2 at indsamle β fra mindst 50 celler af tre uafhængige forsøg, og beregne middelværdien cosinus β med standardfejl på middelværdien (SEM).
- Gentag 6.3.1-6.3.3 for hver eksperimentel betingelse.
BEMÆRK: A cos β på +1 angiver, at alle celler justeres parallelt med den påførte EF, og et 0 værdi indikerer, at alle celler, tilslutter perpendicularly til den anvendte EF.
. 
, Hvor θ er vinklen mellem vektoren af den påførte EF (fra positiv til negativ) og vektoren fra starten til slutningen position af cellen (fig 2G). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chemical-forskydningsspænding (CSS) Chip
CSS chip er lavet af tre PMMA plader, hver med en tykkelse på 1 mm, der er knyttet sammen via to dobbeltsidede bånd, hver med en tykkelse på 0,07 mm (figur 1A og 1B). Den "juletræ" struktur genererer fem relative koncentrationer af 0, 1/8, 1/2, 7/8 og 1 i de fem kultur områder. Ved at udforme kultur område som en trekant, en forskydningsspænding gradient, med en størrelse, relateret volumenstrømmen, fluidik viskositet, og dimensionen af strømningstekniske kanal, skabes i hvert af områderne. Denne chip fastgøres derefter, via en anden 0,07 mm tyk dobbeltsidede tape, til en petriskål til dyrkning af lungekræft CL1-5 celler og blev observeret produktionen af ROS i respons på forskellige kemiske koncentrationer og forskydningsspændinger. Produktionen af ROS i lungekræft celler er stærkt relateret til lung cancer metastaser og udvikling, samt visse kemikalier og forskydningsspænding blev påvist at være involveret i ROS generation 23.
For det første at undersøge virkningen af H 2 O 2, en kemisk stimulus, om produktion af ROS blev celler inkuberet med kontinuerlig strømning af H 2 O 2 løsninger på 0, 25, 100, 175, og 200 uM. Som vist i figur 1C, fluorescensintensiteten steg som koncentrationen af H 2 O 2 steg, hvilket viser, at H 2 O 2 stimulerede produktionen af ROS. Dernæst at undersøge effekten af forskydningsspænding på produktionen af ROS, celler blev udsat for en forskydningsspænding gradient af 0,0048 Pa til 0,0192 Pa. Figur 1D viser, at fluorescensintensiteten steget som forskydningsspændingen forøges (de forskydningsspændinger var den højeste og den laveste i de forreste og bageste områder, henholdsvis), foreslåring, at højere forskydningsspænding induceret mere ROS produktion. Også, var dette CSS chip anvendt til at undersøge produktion af ROS i respons på forskellige koncentrationer af α-tocopherol, blev en antioxidant af en form for vitamin E. Celler stimuleret af forskydningsspænding plus α-tocopherol på 0, 3,2, 12,5, 21,9 og 25 ug / ml. Som vist i figur 1E, for α-tocopherol koncentrationer lavere end 21,9 pg / ml, fluorescensintensiteten nedsat, når koncentrationen forøges, hvilket indikerer virkningen af α-tocopherol i at reducere produktionen af ROS. Men efterhånden som koncentrationen øges til 25 ug / ml, den gennemsnitlige intensitet også steget, hvilket antyder, at denne høje koncentration af α-tocopherol ikke fjerne meget ROS i forhold til lavere koncentrationer.
Chemical-elektriske Field (CEF) Chip
CEF chip er fremstillet af et 1 mm tykt PMMA og en 0,22-mm dobbeltsidet tape med fluide kanaler mønstrede på det (figur 2A og 2B). Tilsvarende "juletræ" struktur skaber fem relative koncentrationer af 0, 1/8, 1/2, 7/8 og 1 i de fem kultur områder. Desuden er disse fem parallelle områder forbundet vinkelret til dannelse af en strømningsteknisk sti er analog med et elektrisk kredsløb. Det elektriske felt, der dannes i en kultur område er relateret til ledningsevne af fluidet, det tværsnitsarealet af kanalen, og den jævnstrøm (DC), der passerer gennem området. Ifølge Kirchhoff spænding lov og Ohms lov, strømmene i de fem kultur områder er 0,49 I, 0,25 I, 0,13 I, 0,08 I, og 0,05 I, henholdsvis hvor I er den anvendte dc (figur 2C). Denne chip er fastgjort via 0,22 mm tyk dobbeltsidede tape, til en petriskål til dyrkning af lungekræft CL1-5 celler at observere cellevandring og production af ROS i respons på forskellige kemiske koncentrationer og elektriske felter.
Først blev denne chip anvendt til at undersøge produktion af ROS i respons på forskellige koncentrationer af honokiol, forskellige styrker af elementærfiler og kombinerede behandlinger af begge. Honokiol, en lille-molekyle polyphenol isoleret fra slægten Magnolia, viste sig at have antiangiogeniske, antiinflammatoriske og antitumoregenskaber i prækliniske undersøgelser 28. Som vist i figur 2D, ROS produceres var næsten den samme for elementærfiler lavere end 67 mV / mm, men blev forøget med stigende elementærfiler over denne værdi. Figur 2E viser, at under kombinerede behandlinger af elektriske felter og honokiol, ROS niveau forblev næsten den samme, hvilket indikerer, at honokiol inhiberede produktionen af eksogent ROS (dvs.., ROS relateret til EF stimulus), især under højere elementærfiler. Migrationen cellen under en enkelt eller sameksisterende kemisk/ elektriske stimuli blev også undersøgt ved hjælp af denne CEF chip. Som det ses i figur 2F, uden tilsætning af honokiol, migration steg som EF styrken øges. Efter tilsætning honokiol af forskellige koncentrationer, migration faldt generelt, hvilket antyder at honokiol reduceret cellemigration eventuelt via inhibering af produktionen af ROS. Migrationen rettethed er vist i figur 2G. I nærvær af EF kun viste lungecancerceller fremtrædende retningsbestemt migrering til anoden (med negative værdier). Efter tilsætning honokiol af forskellige koncentrationer, var der et mindre fald i migration rettethed for alle EF-stimulerede områder.
Figur 1: Chemical-shear stress (CSS) Chip Bruges til at undersøge effekten af kemikalier og forskydningsspændinger på Lung Cancer Cells to.3
(A) Tre lag af PMMA substrater er bundet sammen via to dobbeltsidede tape til dannelse af CSS chip. (B) Den integrerede CSS chip. (C) Top: Fluorescerende og lyse-field billeder af CL 1-5 celler efter behandling med forskellige koncentrationer af H 2 O 2. Scale bar = 50 um. Nederst: Mean fluorescensintensitet med SEM afbildet ved forskellige koncentrationer af H 2 O 2. (D) Top: Fluorescerende billeder af CL 1-5 celler under forskellige forskydningsspændinger. Scale bar = 50 um. Nederst: Mean fluorescensintensitet med SEM afbildet ved forskellige forskydningsspændinger. (E) Top: Fluorescerende og lyse-field billeder af CL 1-5 celler efter at være stimuleret med forskydningsspænding med forskellige koncentrationer af α-tocopherol. Scale bar = 50 um. Nederst: Mean fluorescensintensitet med SEM afbildet ved forskellige koncentrationer af α-tocopherol. Data, der præsenteres her wsom oprindeligt blev offentliggjort i henvisning 23. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Chemical-elektrisk felt (CEF) Chip Bruges til at undersøge effekten af kemikalier og elektriske felter på Lung Cancer Cells 22.
(A) et lag af PMMA er bundet til en dyrkningsskål via en dobbeltklæbende tape til dannelse af CEF chip. (B) Den strømningstekniske mønster af CSS chip. (C) Det ækvivalente elektriske kredsløb i mikrofluid chip. (D) Venstre: Fluorescerende og lyse-field billeder af CL 1-5 celler efter bliver behandlet med forskellige styrker af elementærfiler. Scale bar = 50 um. Til højre: Mean fluorescerendeintensitet med SEM plottet ved forskellige styrker af elementærfiler. (E) Venstre: Lysstofrør og lyse-field billeder af CL 1-5 celler efter bliver behandlet med kombineret honokiol og elementærfiler. Scale bar = 50 um. Til højre: Mean fluorescerende intensitet med SEM plottet ved kombineret honokiol og elementærfiler. (F) De migration satser CL1-5 celler efter bliver behandlet med elementærfiler kun (markeret som kontrol) og kombineret honokiol og elementærfiler (markeret som honokiol). (G) Migrationen rettethed af CL1-5 celler efter at være behandlet med elementærfiler kun (markeret som kontrol) og kombineret honokiol og elementærfiler (markeret som honokiol). Data præsenteret her blev oprindeligt offentliggjort i henvisning 22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PMMA-baserede chips er fremstillet ved hjælp af laser ablation og skrivning, som er billigere og lettere metoder i forhold til PDMS-baserede chips, som kræver mere kompliceret blød litografi. Efter at designe en mikrofluid chip, kan fremstilling og samling ske inden for blot 5 min. Der er nogle kritiske trin, der skal betales opmærksomhed i at udføre eksperimentet. Den første er "samle" spørgsmål. Adapterne skal limes korrekt til det øverste lag af chippen. Lim kan lække ind i de strømningstekniske kanaler, hvis for meget er anvendt, og væske kan lække ud af chippen, hvis der bruges for lidt lim. Også i samle PMMA substrater og de dobbeltsidede tape, er det vigtigt at lægge pres på tryk hele chippen stramt for at undgå enhver væske lækage. Den anden er den "boble" spørgsmål. At fjerne bobler, er 1x PBS kontinuerligt strømmet ind i strømningstekniske kanal i 1 eller 2 minutter ved en flowhastighed på 20 ul / min, og derefter chippen er psnøret inde i en inkubator natten over under 5% CO2 ved 37 ° C. Hvis der er bobler forbliver inden for strømningstekniske kanaler, vil strømningen være uensartet, hvilket forårsager ikke-homogen kemisk koncentration og EF distribution. Den tredje er "celle loading" problem. Antallet af celler fyldt i kultur områder bør velkontrolleret. Hvis cellen nummer er for lav, bør gennemføres mange eksperimentelle kørsler til at indsamle nok data til statistisk formål. Hvis cellen er for højt, vil det være vanskeligt at skelne de enkelte celler og kvantificere deres migration.
I CSS chip, en "juletræ" struktur kombineret med en trekantet kultur område genererer forskellige kemiske koncentrationer på fem områder, som hver har en forskydningsspænding gradient. Fluide forskydningsspændinger var kendt for at påvirke den vedhæftede fil, morfologien, migreringen, og aktiviteten af cellerne. Forskydningsspændinger af så lav som 0,25-0,6 Pa kunne grænseflade cellebindingOg endnu højere værdier af spændinger (0,5 -10 Pa) blev rapporteret at fjerne adhærerende celler 29. Laminare forskydningsspændinger i området fra 0,8 til 1.5 Pa induceret cellejustering i strømningsretningen 30, og endnu lavere værdier (0,1-1 Pa) var kendt for at påvirke cellulær morfologi og permeabilitet 29. Desuden glatte muskelceller udsat for shear stress 2-120 Pa oplevet et fald i celle nummer 31. Lu et al. rapporterede design og konstruktion af mikrofluidenheder shear til kvantitativ analyse af celleadhæsion 27. Forskydningsspændingen i fluidik kanal blev modificeret ved at ændre dimensionerne af kanalen. Chin et al. beskrev en hæmodynamisk Lab-on-a-chip system til styring af strømningshastigheden af dyrkningsmediet i mikro-kanal at efterligne strømningsprofil af blodet i karret 32. Forskydningsspændingen i fluidik kanal blev modificeret ved at ændre strømningshastigheden af mediet. iSE to enheder, selv om en forskydningsspænding på nogen værdier kunne genereres, kun en enkelt værdi var tilgængelig inden for en kultur område på én gang. Til sammenligning har den foreliggende CSS chip den fordel, at en forskydningsspænding gradient i en trekantet område, hvilket øger den eksperimentelle gennemløb især for en screening formål.
I CEF chip, kultur- områder af "juletræet" -struktur er vinkelret forbundet for at danne en strømningsteknisk sti er analog med et elektrisk kredsløb. På et anvendt jævnstrøm, er fem ELEMENTÆRFILEN styrker genereret inde i kultur områder med hver har en strøm af en specifik kemisk koncentration. Konventionelt electrotactic eksperimenter blev udført på petriskåle, hvor der kunne opstå problemer med upræcise elementærfiler, medium fordampning, stor celle / reagensforbrug og forøget joule-opvarmning. Lukkede, miniature mikrofluidenheder effektivt overvinde disse ulemper. For eksempel, at studere electrotaxis of menneskelige blod memory T-celler, Lin et al. rapporterede en plastik mikrofluidanordning indeholder to identiske, side-by-side mikro-kanaler, to modificerede pipettespidser tjente som mellemstore reservoirer, og to platin elektroder til EF ansøgning 15. For at øge gennemløb blev PMMA-baserede electrotactic chips fremstillet til at give flere EFs styrker i én enkelt enhed 12,33. Også mikrovæskeanordninger stand til at generere kontrollerbar kemisk og elektrisk stimuli samtidig er af stor interesse. Li et al. fabrikeret en PDMS-baserede mikrofluidanordning at generere en enkelt eller sameksisterende kemiske gradienter / elementærfiler for at undersøge det kemotaktiske eller electrotactic migrering af T-celler 14. Kao et al. Ansat en lignende mikrofluidanordning at modulere kemotaksis af lungecancerceller ved hjælp elementærfiler 12. I disse to enheder, blev en Y-formet struktur anvendes til at skabe en stabil koncentrationsgradient i en enkelt anvendt EF. Hou et al. rapporterede en multikanal-dual-elektrisk-felt chip til at studere den samtidige virkning af kemikalier og elementærfiler på lungecancerceller 21. Denne enhed var i stand til at levere 8 kombinationer af elektriske / kemiske stimuli (2 elektrisk x 4 kemiske) i et eksperiment. Selvom gennemløb steget, blev denne chip kapacitet begrænset til (1) kun én EF styrke (plus et nul som en kontrol), og (2) er påkrævet fire sprøjtepumper til pumpning kemikalier i fire uafhængige kanaler. Til sammenligning har den foreliggende CEF chip den fordel at frembringe fem ELEMENTÆRFILEN styrker sammen med fem kemiske koncentrationer via et enkelt sæt af elektroder og 2 sprøjtepumper.
Selv om disse chips er nemme skal fremstilles, de har nogle begrænsninger. Først kan genereres kun fem "specifikke" koncentrationer og fem "specifikke" EFs styrker. For det andet kan bredden af den strømningstekniske kanal ikke være mindre end 1 mm på grund fokusering afCO 2 laserstråle. Men ved præcist at styre den kemiske koncentration i indløbet og elektrisk strøm passerer gennem strømningstekniske kanal, kan enhver koncentrering og EF styrker kan opnås i kulturen områder. Afslutningsvis den foreliggende CSS og CEF chips er stand til at tilvejebringe celler med styrbare enkelt eller sameksisterende kemisk / elektrisk / shear stress stimuli. I et enkelt CSS chip, kan genereres fem forskellige kemiske koncentrationer i kombination med en forskydningsspænding gradient. Endvidere i et enkelt CEF chip, kan oprettes fem forskellige kemiske koncentrationer i kombination med fem ELEMENTÆRFILEN styrker. Ved at øge grene af "juletræet" struktur, kan gennemstrømningen af disse chips øges yderligere. Disse chips er vist sig at være en nem, tidsbesparende, pålidelige, og high-throughput platform for studier af cellulær adfærd under kemisk / elektrisk / shear stress stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
- Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- Adler, J.
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
- Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
- Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
- Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
- Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
- Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
- Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
- Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
- Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
- Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
- Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
- Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
- Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
- Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
