Summary
Lo dimostra un protocollo per la riduzione eterogeneità spaziali di segnali di ioni in spettrometria di massa MALDI regolando la temperatura del substrato durante i processi di essiccazione del campione.
Protocol
NOTA: Questo protocollo è sviluppato per ridurre l'eterogeneità spaziale maltotrioso e bradichinina frammento (1-7) preparato con il metodo essiccati gocciolina. Il protocollo consiste di tre fasi principali, compresa la preparazione e precondizionamento, la deposizione del campione e l'essiccazione, e l'analisi dei dati di spettrometria di massa. Le procedure sono delineati e descritti più in dettaglio qui di seguito:
1. Preparazione e precondizionamento
- Pulizia del piatto del campione
- Indossare guanti di nitrile e mano-lavare delicatamente la piastra campione con detergente e acqua distillata-deionizzata (DDW).
- Lavare il piatto del campione con metanolo (MeOH) e DDW.
- Inserire la piastra campione in un becher da ml 600 e riempire con DDW.
- Sonicare piatto del campione in DDW per 15 minuti in un bagno a ultrasuoni (200 W, 40 kHz).
- Rimuovere DDW dal bicchiere e riempire il bicchiere con MeOH.
- Sonicare piatto del campione in MeOH per 15 minuti in bagno ad ultrasuoni (200 W, 40 kHz).
- Soffiare via le gocce di solvente sul piatto con gas azoto e mantenere la piastra campione asciutto prima deposizione del campione.
- Regolazione della temperatura di asciugatura Camera
NOTA:. La camera di essiccazione è un 35 x 20 x 45 cm 3 (L x P x A) camera di acrilico La figura 1 mostra l'immagine di questo sistema di asciugatura. La camera è pulita con temperatura ambiente azoto gassoso attraverso un misuratore di flusso di gas ad una portata costante per mantenere una condizione di bassa umidità relativa monitorata da un igrometro calibrato installato all'interno della camera di essiccazione. Un blocco base di rame nella camera di essiccazione dotato di una costante circolatore dell'acqua temperatura programmata Serve per targhe di esempio in acciaio inox. Il blocco base in rame è in grado di regolare la temperatura della piastra del campione da 5 a 25 ° C. Le temperature dell'aria, blocco base di rame, e la piastra sono controllate da K-termocoppie.- Aprire la porta e rapidamente mettere piatto del campione sul rameblocco di base quindi chiudere la porta.
- Regolare manualmente il misuratore di portata di gas per impostare il flusso di azoto a 10 piedi cubi standard per ora (SCFH).
- Monitorare l'umidità relativa nella camera di essiccazione dal igrometro e calibrare il misuratore di portata di gas per assicurare l'umidità relativa è sempre inferiore al 25%.
- Monitorare la temperatura del piatto del campione mediante termocoppie di tipo K e regolare manualmente la temperatura dell'acqua circolatore finché la piastra campione raggiunge 5 ° C per esperimento oa temperatura ambiente (25 ° C) per il controllo.
NOTA: Al fine di stabilizzare il piatto del campione ad una temperatura progettato, la temperatura dell'acqua circolatore è in genere impostato tra 0 e 5 ° C inferiore rispetto al campione progettato. Ad esempio, per mantenere 5 ° C al piatto del campione, la temperatura del circolatore acqua è nell'intervallo da 0 a 2 ° C; per mantenere la piastra di campione a 25 ° C, la temperatura del circolatore acqua è nell'intervallo da 23 a 25 ° C. - Assicurarsi che le temperature richieste e l'umidità relativa vengono raggiunti (Tabella 1) prima della deposizione del campione.
NOTA: Tutti i parametri ei loro valori di regolazione per i processi di essiccazione a temperature diverse piastre campione sono riportati in Tabella 1.
NOTA: A bassa temperatura piatto del campione, condensa sulla piastra campione può verificarsi se la porta della camera aperta per lungo tempo. In caso di condensa di acqua, chiudere la porta e NON depositare qualsiasi campione su di esso fino a quando la formazione di condensa è asciugata.
- Preparazione di Matrix e Analita Solutions
- Preparazione delle soluzioni matrice
- Preparare 0,1 soluzione M THAP con il 50% acetonitrile (ACN): 50% soluzione acquosa DDW.
- Preparazione di analiti
- Preparare 10 -4 soluzione maltotriosio M con DDW.
- Preparare 10 -5 M frammento bradichinina (1-7) soluzione nel 50% acetonitrile(ACS): 50% soluzione acquosa DDW.
- Preparazione delle soluzioni matrice
2. Deposizione del campione e asciugatura
- Premix 0,25 ml di soluzione di THAP 0,1 M e 0,25 ml di 10 -4 M maltotriosio o 10 -5 M frammento bradichinina (1-7) soluzioni in una provetta.
- Agitare la soluzione mista per 3 sec.
- Centrifugare la soluzione mista per 2 sec (2.000 xg) per raccogliere la soluzione al fondo della provetta.
- Aprire la porta della camera di essiccazione, accuratamente depositare 0,1 ml di soluzione sul piatto del campione con pipetta e chiudere immediatamente la porta.
- Attendere che la goccia del campione si asciughi.
. NOTA: I tempi di essiccazione tipicamente osservati con differenti temperature piatto del campione sono elencati nella tabella 1 per la temperatura della piastra campione di 5 ° C, il tempo medio di asciugatura è di 800 a 1.000 sec; per temperatura della piastra campione di 25 ° C, il tempo medio di essiccazione è da 100 a 150 sec. - Dopo l'essiccazione, aprire la porta della camera di essiccazione.
- Impostare la temperatura dell'acqua circolatore a temperatura ambiente (25 ° C).
NOTA: Saltare questo punto se la piastra campione viene mantenuta costantemente a temperatura ambiente (25 ° C) durante il processo di essiccazione. - Dopo la temperatura della piastra campione ritorni a temperatura ambiente (25 ° C), rimuovere la piastra campione dalla camera di essiccazione.
- Esaminare la morfologia del campione allo stereomicroscopio 5X e prendere l'immagine in campo chiaro un'istantanea.
NOTA: Se le morfologie cristalline non sono come previsto, è necessario preparare un nuovo campione con la stessa procedura. Morfologie cristalline tipiche sono illustrate nei pannelli superiori della figura 2.
NOTA: Nei casi con temperature piastra campione basse, ad esempio 5 ° C, è importante riscaldare il piatto del campione a temperatura ambiente, mette fuori dalla camera di essiccazione. All'atto del deposito dei campioni, non mantenere la solutio premiscelaton nella punta della pipetta di oltre 10 secondi. NON usare di nuovo la soluzione premiscelata dopo aver depositato i campioni. I pannelli superiori della figura 2 mostrano immagini in campo chiaro di campioni preparati con diverse temperature della piastra del campione.
Analisi 3. Spettrometria di massa dei dati
- Spettrometria di Massa Data Acquisition
NOTA: Dopo la preparazione, il campione può essere analizzato utilizzando la spettrometria di massa imaging. Nel corso di studio, gli esperimenti di imaging MS sono condotti utilizzando un sincronizzato TOF doppia polarità laboratorio integrato (DP-TOF) spettrometro di massa di imaging. 15 Commercial MALDI-TOF spettrometri di massa con capacità di imaging sono adatti a tali esperimenti anche. Lo spettrometro di massa è gestito in estrazione lineare e modalità di ioni positivi con ritardi di estrazione ottimizzate. L'energia cinetica degli ioni è di 20 kV. La dimensione del fascio laser è di 35 micron di diametro sulla superficie del campione, e lo spettro di ogni punto è la avela rabbia di 5 colpi laser.- Inserire la piastra del campione nello spettrometro di massa MALDI.
- Eseguire l'imaging spettrometria di massa per il campione preparato nei passaggi 2.1-2.9.
- Selezionare un picco di massa caratteristica dall'elenco di massa mostrato nella finestra dei risultati e fare clic su "2D" per tracciare un'immagine ioni bidimensionale.
NOTA: Per maltotriosio mescolato con THAP, i picchi caratteristici sono sodiated maltotriosio, THAP protonata e sodiated THAP. Per frammento bradichinina (1-7) miscelato con THAP, i picchi caratteristici comprendono protonati frammento bradichinina (1-7), protonata THAP, e sodiated THAP. - Fare clic sui pulsanti di regolazione nella finestra pop-up per determinare i limiti superiore e inferiore della intensità del segnale e fare clic su "salvare un'immagine". Questa impostazione definisce il contrasto delle immagini di ioni.
NOTA: in ogni set individuale dei dati, le regioni e le macchie screpolate nulli mostrano bassa luminosità sono eliminati. - Osservare e confrontare lo ioneimmagine l'immagine in campo chiaro che è stata presa al punto 2.9 con.
NOTA: imaging con spettrometria di massa e costruzione di immagini di particolari ioni può essere realizzato con strumenti commerciali. A causa della varietà di acquisizione dati e software di analisi, gli utenti devono seguire le istruzioni software forniti dal fornitore dello strumento per ottenere immagini di alta qualità.
- Analisi dei dati
NOTA: L'eterogeneità dei campioni viene analizzato quantitativamente. In questa dimostrazione, ogni campione viene diviso in più zone concentriche di software sviluppati internamente per analizzare la distribuzione spaziale degli ioni. L'analisi può essere eseguita anche utilizzando software di analisi dati stand-alone.- Clicca i punti nulli e le regioni incrinate l'immagine di ioni mostrata nella finestra dei risultati in per rimuovere aree non importanti.
NOTA: Questa procedura definisce l'area essenziale dell'immagine ionico. - Fare clic sul pulsante "edge trovare" per trovare strato esterno dell'immagine di ioni.
- Fai clic su "dedurre" per salvare le informazioni ioni abbondanza dello strato esterno in un database e rimuovere questo strato dall'immagine ioni contemporaneamente. Una casella di controllo che rappresenta questo strato più esterno apparirà nel "dati di uscita" lista della finestra dei risultati.
- Ripetere i punti 3.2.2 e 3.2.3 fino viene definito il centro dell'immagine ione.
- Fare clic e selezionare tutte le caselle di controllo nella lista "dati di uscita" e fare clic su "Esporta" per esportare i dati.
- Aprire i dati esportati utilizzando il software foglio di calcolo per calcolare l'abbondanza media di ioni di ogni livello per ottenere le informazioni distribuzione spaziale degli ioni.
- Clicca i punti nulli e le regioni incrinate l'immagine di ioni mostrata nella finestra dei risultati in per rimuovere aree non importanti.
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Representative Results
Le immagini in campo chiaro e le immagini MS di maltotrioso e bradichinina frammento (1-7) preparato con temperatura della piastra campione di 5 e 25 ° C sono mostrati in Figura 1. Nel caso di maltotriosio sodiated, il segnale ione principalmente popola alla periferia dell'area campione quando viene preparato con una temperatura della piastra campione di 25 ° C. Diminuendo la temperatura della piastra del campione a 5 ° C, il segnale popola omogeneamente su tutta la superficie del campione. L'unico aspetto negativo evidente quando la preparazione dei campioni di sotto dei 5 ° C è che ci sono più le crepe che i campioni preparati sotto i 25 ° C. L'immagine di ioni di frammento bradichinina protonato (1-7) mostra un andamento simile a quelli di maltotriosio sodiated. I risultati di formazione immagine SM suggeriscono che la preparazione dei campioni sotto una temperatura della piastra del campione inferiore può ridistribuire in modo significativo le molecole e ridurre l'eterogeneità.
la figura 3 mostra i risultati delle analisi statistiche per maltotrioso e bradichinina frammento (1-7), preparato a temperature piastra del campione di 5 e 25 ° C. Per ogni campione, l'intensità media è normalizzata. Nel caso di maltotriosio sodiated con una temperatura della piastra campione di 25 ° C, le intensità dei segnali sui centri sono molto inferiori a quelli con la temperatura della piastra campione di 5 ° C. Il risultato di frammento bradichinina protonato (1-7) mostra anche meno variazione quando diminuendo la temperatura della piastra di esempio da 25 a 5 ° C.
Figura 1: Immagine del sistema di campionamento di asciugatura.La camera di essiccazione è fatto di acrilico. La camera è pulita con azoto a temperatura ambiente per mantenere una condizione di bassa umidità relativa. Un blocco base in rame dotato di una costante circolatore dell'acqua temperatura programmata viene utilizzato per regolare la temperatura delle targhe di esempio acciaio inossidabile. I termometri monitorano l'aria, blocco di base in rame, e la piastra del campione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. L'abbassamento del campione risultati temperatura della piastra in una migliore omogeneità del segnale Le immagini in campo chiaro (immagini superiori), così come le immagini MALDI (immagini inferiori) di maltotriosio (a) e frammento di bradichinina (1-7) (b) preparato con THAP sotto diverse temperature della piastra del campione. il MALDI immagini sono state ottenute estraendo il maltotriosio sodiated (m / z: 527) e frammento bradichinina protonato (1-7) (m / z: 757) dallo spettro totale, rispettivamente. La dimensione dei pixel delle immagini di ioni è di 35 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: variazione del segnale riduce la temperatura piastra del campione diminuisce durante l'essiccazione Le immagini sono ottenute con MALDI maltotriosio (a) e frammento di bradichinina (1-7) (b) preparato con THAP sotto diverse temperature della piastra campione.. Dati blu rosso e indicano il campione preparato alle temperature della piastra campione di 25 e 5 ° C, rispettivamente.g "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Esempio Piastra Temperatura (° C) | Campione | Temperatura dell'aria (° C) | Umidità relativa (RH%) | Tempo di asciugatura (sec) |
| 5 | maltotriosio con THAP | 20 ± 3 | <25 | 800 - 1.000 |
| frammento di bradichinina (1-7) con THAP | ||||
| 25 | maltotriosio con THAP | 25 ± 3 | 100 - 150 | |
| frammento di bradichinina (1-7) con THAP |
Tabella 1: parametri sperimentali e condizioni di essiccazione sotto diverse temperature della piastra del campione.
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Discussion
Sulla base di precedenti previsioni teoriche, temperatura indotta flussi idrodinamici all'interno gocce possono superare verso l'esterno flussi capillari indotte da evaporazione del solvente. L'efficacia di tale ricircolo interno delle molecole è maggiore quando la temperatura gradienti di un aumento gocciolina. Secondo i risultati previsti, quando mantenendo la temperatura della piastra campione sotto 5 ° C, mantenendo l'ambiente circostante a temperatura ambiente, la velocità media dei flussi di ricircolo all'interno della gocciolina è circa 4 volte superiore a quella dei flussi capillari esteriori. Se la temperatura della piastra del campione è lo stesso come l'ambiente, la velocità media del flusso di ricircolo è 1.800 volte più lento del flusso capillare verso l'esterno. I risultati di tale calcolo indicano che la diminuzione della temperatura piastra campione durante la preparazione del campione è vantaggioso. Le osservazioni sperimentali sono d'accordo con questa previsione.
Il temperamento piastra di campioneature deve essere controllata con precisione in tutto il campione preparato processo. Tabella 1 mostra il tempo tipico gocciolina di asciugatura con 0,1 ml di campione in diverse temperature della piastra campione. Prima di depositare soluzione campione sul piatto, è importante garantire che la superficie della piastra campione è asciutto. Se la formazione di condensa si verifica durante la preparazione dei campioni a basse temperature, la deposizione della soluzione del campione non è consigliabile perché l'acqua condensata allarga aree campione e diluisce soluzioni. Pertanto, è importante mantenere l'umidità relativa della camera di essiccazione sotto del 25%. Inoltre, durante la preparazione dei campioni a basse temperature, la piastra campione dovrebbe essere caldo fino a temperatura ambiente, mette fuori dalla camera di essiccazione. Sebbene minore condensa dopo il completamento di cristallizzazione del campione non altera il campione di popolazione, significativa condensa deve essere evitata.
L'uso di soluzioni premiscelati di fresco è raccoriparato. Una volta che le soluzioni premiscelati sono esposti all'aria, pre-cristallizzazioni delle soluzioni campione verificano e la dimensione dei cristalli finali e morfologia possono variare. Pertanto, la procedura di dispensazione deve essere eseguita con efficienza ragionevole, di solito entro 10 secondi, per evitare che la goccia campione pre-cristallizzazione all'interno della punta della pipetta. Si raccomanda di osservare morfologie campione al microscopio per assicurare adeguati morfologie di cristallo sono prodotti prima della spettrometria di massa. Se le morfologie cristalline non sono buone come previsto, ripetendo il processo di deposizione secondo necessità.
Secondo i nostri studi teorici e sperimentali, la preparazione di campioni con un piatto del campione a bassa temperatura installato in condizioni ambientali migliora notevolmente la riproducibilità dei dati e la qualità in MALDI-MS. Successivi esperimenti mostrano anche notevole miglioramento dell'intensità del segnale con questo metodo di preparazione del campione. I dati sperimentali ottenuti da til suo metodo migliora notevolmente l'affidabilità spettri di massa MALDI per analisi quantitative. In confronto con altri metodi coinvolgono composizione soluzione o modifiche delle proprietà superficiali, 8,16-18 condizione cambio di essiccazione è più semplice e più generalmente applicabile per i campioni convenzionali. Così, la maggior parte degli utenti di spettrometria di massa possono trarre beneficio da esso in applicazioni regolari.
Migliorare MALDI l'omogeneità del segnale con la diminuzione della temperatura della piastra del campione è efficace anche per alcune altre matrici popolari. Ad esempio, una migliore α-ciclodestrina (α-CD) l'omogeneità del segnale con THAP e α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA) come la matrice in condizioni di campione di essiccazione a bassa temperatura è stato riportato di recente. 14 Lo svantaggio con piastra campione che cambia temperatura è che il metodo attualmente inadatto per analisi ad alta produttività a causa del lungo tempo di asciugatura del campione in condizioni di bassa temperatura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) | Sigma-Aldrich | T64602 | |
| Bradykinin fragment (1-7) | Sigma-Aldrich | B1651 | |
| Maltotriose | Sigma-Aldrich | 47884 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 ml beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | this lab | ||
| Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) | this lab | ||
| MALDI-TOF stainless steel sample target | this lab |
References
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption. Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).
- Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).
- Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).
- Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).
- Hu, H., Larson, R. G. Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate. J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).
- Deegan, R. D., et al. Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
- Hu, H., Larson, R. G. Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions. J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).
- Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study. New J. Phys. 11, 075020 (2009).
- Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop. J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).
- Probstein, R. F. Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).
- Lai, Y. -H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).
- Hsiao, C. -H., et al. Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).
- Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation. Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).
- Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).
- Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting. Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).
