Summary
Протокол для уменьшения пространственных неоднородностей ионных сигналов в MALDI масс-спектрометрии с помощью регулирования температуры подложки во время процессов сушки образцов демонстрируется.
Protocol
Примечание: Этот протокол разработан для уменьшения пространственной неоднородности мальтотриоза и брадикинина фрагмента (1-7), полученного с использованием метода высохших капель. Протокол состоит из трех основных этапов, включая подготовку и предобусловливанием, осаждение образца и сушки, а также масс-спектрометрического анализа данных. Процедуры изложены и описаны более подробно ниже:
1. Подготовка и Предобусловливание
- Очистка образца плиты
- Надеть нитриловые перчатки и ручной мыть образец пластины аккуратно с моющим средством и дистиллированной деионизированной воды (DDW).
- Промыть образец стекла с метанолом (MeOH) и DDW.
- Вставьте образец пластины в стакане емкостью 600 мл и залить DDW.
- Разрушать ультразвуком образца пластины в DDW в течение 15 мин в ультразвуковой ванне (200 Вт, 40 кГц).
- Удалить DDW из стакана и залейте стакан с метанолом.
- Разрушать ультразвуком образца пластины в MeOH в течение 15 мин в ультразвуковой ванне (200 Вт, 40 кГц).
- Сдувать растворителя капли на пластине с газообразным азотом и держать образец пластины сухой перед нанесением образца.
- Регулирование температуры сушильной камеры
Примечание:. Сушильная камера 35 х 20 х 45 см 3 (Ш х Г х В ) акриловой камеры На рисунке 1 показана картина этой системы сушки. Камера продувается при комнатной температуре газообразным азотом через газовый расходомер при постоянной скорости потока для поддержания состояния низкой относительной влажности отслеживается с помощью калиброванного гигрометра, установленной внутри сушильной камеры. Медное основание блока в сушильной камере, оснащенной запрограммированной постоянной циркулятор температуры воды используется для размещения образцов из нержавеющей стали пластины. Медное основание блок способен регулировать температуру образца плиты от 5 до 25 ° C. Температуры воздуха, меди базового блока и образец пластины контролируются термопарами К-типа.- Откройте дверь и быстро поместить образец пластину на медибазовый блок затем закройте дверцу.
- Ручная регулировка газового расходомера, чтобы установить скорость потока азота до 10 стандартных кубических футов в час (SCFH).
- Монитор относительную влажность воздуха в сушильной камере с помощью гигрометра и точной настройки газа расходомер для обеспечения относительной влажности воздуха всегда ниже 25%.
- Контролировать температуру образца пластины термопарами К-типа и регулировать температуру воды циркулятора вручную, пока образец пластина не достигнет 5 ° С в течение эксперимента или при комнатной температуре (25 ° C) для контроля.
Примечание: Для того, чтобы стабилизировать образец стекла при заданной температуры, температура воды циркуляционный обычно устанавливается от 0 до 5 ° С ниже, чем проектируемого образца. Например, чтобы поддерживать на 5 ° C на образце пластины, установка температуры воды циркулятора, находится в диапазоне от 0 до 2 ° C; для поддержания образца пластины при температуре 25 ° С, значение температуры воды циркулятора находится в диапазоне от 23 до 25 ° С. - Обеспечение требуемых значений температуры и относительной влажности достигаются (таблица 1) перед нанесением пробы.
Примечание: Все параметры, а также их значения параметров для процессов сушки с различными температурами образца пластины приведены в таблице 1.
Примечание: При низкой температуре образца плиты, конденсацию воды на образце пластины может произойти, если дверь камера открыта в течение длительного времени. Если происходит конденсация воды, закройте дверцу и не предъявляйте любой образец на нем до конденсации воды не высохли.
- Получение матричных и аналита решений
- Получение матричных решений
- Готовят 0,1 М раствора Тап с помощью 50% ацетонитрила (ACN) 50% -ного водного раствора DDW.
- Получение аналитов
- Приготовьте 10 -4 М мальтотриозу раствор с пониженным содержанием дейтерия.
- Приготовьте 10 -5 М фрагмент брадикинина (1-7) в раствор 50% ацетонитрила(АКС): 50% -ный водный раствор DDW.
- Получение матричных решений
2. Образец Отложение и сушки
- Премикс 0,25 мкл 0,1 М раствора Тап и 0,25 мкл 10 -4 М мальтотриоза или 10 -5 М фрагмента брадикинина (1-7) растворов в микроцентрифужных трубки.
- Vortex смешанный раствор в течение 3 сек.
- Центрифуга смешанного раствора в течение 2 с (2000 XG) для сбора раствора в нижней части трубки центрифуги.
- Откройте дверцу сушильной камеры, тщательно депонировать 0,1 мкл раствора на образце пластины с пипеткой и закрыть дверь немедленно.
- Подождите, пока образец капли, чтобы высохнуть.
. Примечание: обычно наблюдаемые время сушки с различными температурами образца пластины приведены в таблице 1 для температуры образца пластины 5 ° С, среднее время сушки составляет от 800 до 1000 с; для измерения температуры образца пластины 25 ° С, среднее время сушки составляет от 100 до 150 летес. - После сушки, откройте дверцу сушильной камеры.
- Установите температуру воды циркуляционного до комнатной температуры (25 ° C).
Примечание: Пропустить этот шаг, если образец пластина постоянно хранится при комнатной температуре (25 ° C) в процессе сушки. - После того как температура пластины примере возвращается к комнатной температуре (25 ° C), удалить образец пластины из сушильной камеры.
- Изучение морфологии образец под стереомикроскопа 5X и взять ярко-поле моментальный снимок.
Примечание: Если кристалл морфологию не как ожидалось, необходимо подготовить новый образец с той же процедурой. Типичные морфологию кристаллические показаны на верхних панелях на фиг.2.
Примечание: В случаях с низкими температурами пластины образца, например, 5 ° С, важно, чтобы нагреть образец пластины до комнатной температуры, прежде чем принимать его из сушильной камеры. При сдаче на хранение образцов, не держат предварительно приготовленного SOLUTIOп в кончика пипетки в течение 10 сек. НЕ использовать заранее приготовленный раствор снова после внесения образцов. Верхние панели Рисунок 2 показывают ярко-полевые изображения образцов , приготовленных с различными температурами образца пластины.
Анализ 3. Данные масс-спектрометрии
- Масс-спектрометрия сбора данных
Примечание: После подготовки, образец может быть проанализирован с помощью масс-спектрометрии изображений. В настоящем исследовании, формирующую изображение эксперименты MS проводят с использованием лабораторного встроенной синхронизированную с двойным полярности TOF (DP-TOF) масс - спектрометр с формированием изображения. 15 масс - спектрометры коммерческого MALDI-TOF с возможностью формирования изображения также подходят для таких экспериментов. Масс-спектрометр работает в линейной экстракции и положительных ионов с режимами оптимизированными задержки экстракции. Кинетическая энергия ионов составляет 20 кВ. Размер лазерного пучка составляет 35 мкм в диаметре на поверхности образца, а спектр каждого пятна прярость 5 лазерных выстрелов.- Вставьте образец пластины в MALDI масс-спектрометра.
- Выполнение визуализации масс-спектрометрического анализа для образца, полученного на этапах 2.1-2.9.
- Выберите характерный пик массы из списка масс-показанного в окне результата и нажмите кнопку "2D", чтобы построить двумерный ионное изображение.
Примечание: Для получения мальтотриозу смешанного с Тап, характерные пики sodiated мальтотриозу, протонированных Тап и sodiated Тап. Для фрагмента брадикинина (1-7), смешанной с Тап, характерные пики включают протонированные фрагмент брадикинина (1-7), протонированных Тап и sodiated Тап. - Нажмите кнопки регулировки во всплывающем окне, чтобы определить верхний и нижний пределы интенсивности сигнала и нажмите кнопку "Сохранить изображение". Этот параметр определяет контраст ионных изображений.
Примечание: В каждом отдельном наборе данных, то сломанные регионы и нулевые пятна, показывающие низкую яркость устраняются. - Наблюдать и сравнить ионизображение с ярко-поле изображения, которое было принято на шаге 2.9.
Примечание: Визуализация масс-спектрометрии и построение образов отдельных ионов может быть достигнуто с коммерческими инструментами. В связи с разнообразием сбора данных и программного обеспечения для анализа, пользователи должны следовать инструкциям программного обеспечения, предоставленного прибора поставщика, чтобы получить высокое качество изображения.
- Анализ данных
Примечание: Неоднородность образцов анализируют количественно. В этой демонстрации, каждый образец делится на несколько концентрических областей с помощью программного обеспечения собственной разработки для анализа пространственного распределения ионов. Анализ также может быть выполнен с использованием автономного программного обеспечения для анализа данных.- Нажмите нулевые пятна и трещины областей в изображении ионов отображается в окне результата для удаления несущественных областей.
Примечание: Эта процедура определяет существенную область ионного изображения. - Нажмите кнопку "край найти", чтобы найти слой крайнем ионного изображения.
- Нажмите кнопку "вычитать", чтобы сохранить информацию о ионом пресыщение слоя в самому дальнему от центра базы данных и удалить этот слой из ионного изображения одновременно. Флажок, представляющий этот слой будет крайнем появится в списке "выходных данных" окна результатов.
- Повторите шаги 3.2.2 и 3.2.3 до центра иона изображения не определяется.
- Нажмите и выберите все флажки в списке "выходных данных" и нажмите кнопку "Экспорт", чтобы экспортировать данные.
- Откройте экспортированные данные с помощью программного обеспечения электронной таблицы для расчета среднего иона обилие каждого слоя, чтобы получить информацию о пространственном распределении ионов.
- Нажмите нулевые пятна и трещины областей в изображении ионов отображается в окне результата для удаления несущественных областей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изображения светлого поля, а также изображения МС мальтотриоза и брадикинина фрагмента (1-7) , полученного с температурой образца пластины 5 и 25 ° С, показаны на рисунке 1. В случае sodiated мальтотриоза, ионного сигнала в основном заполнит на периферии участка образца, когда он приготовлен с температурой образца пластины 25 ° с. При понижении температуры образца пластины до 5 ° C, сигнал заполнит равномерно по всей площади образца. Единственным заметным недостатком при подготовке образцов при 5 ° С, что есть больше, чем трещины образцов, полученных при 25 ° С. Ионный изображение протонированного фрагмента брадикинина (1-7) показывает аналогичную тенденцию, как и у sodiated мальтотриозы. Результаты визуализации MS позволяют предположить, что подготовки образцов при более низкой температуре образца пластины может существенно перераспределить молекулы и уменьшить разнородность.
рисунке 3 представлены результаты статистического анализа для мальтотриоза и брадикинина фрагмента (1-7) , полученного при температурах образца пластины 5 и 25 ° с. Для каждого образца, средняя интенсивность нормализована. В случае sodiated мальтотриоза с температурой образца пластины 25 ° С, интенсивности сигналов в центрах значительно ниже, чем те, с температурой образца пластины 5 ° С. Результат протонированного фрагмента брадикинина (1-7) также показывает меньшую вариацию при уменьшении температуры пластинки образца от 25 до 5 ° С.
Рисунок 1: Изображение системы образца сушки.Сушильная камера изготовлена из акрила. Камера продувают газообразным азотом при комнатной температуре, чтобы поддерживать состояние низкой относительной влажности. Медное основание блок оснащен запрограммированной постоянной циркулятор температуры воды используется для регулирования температуры из нержавеющей стали образца пластин. Термометры мониторинга воздуха, медный базовый блок, а образец пластины. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Понижение температуры образца приводит пластины в лучшей однородности сигнала Светлые поля изображения (верхние изображения), а также MALDI изображения (нижние изображения) из мальтотриозы (а) и фрагмента брадикинина (1-7) (б) полученный с Тап при различных температурах образца пластины. MALDI Изображения были получены путем экстракции sodiated мальтотриоза (m / z: 527) и протонированные фрагмент брадикинина (1-7) (m / z: 757) из общего спектра, соответственно. Размер пикселя ионных изображений составляет 35 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: изменение сигнала уменьшается , как температура образца пластины уменьшается во время процесса высушивания MALDI изображения получены с мальтотриоза (а) и фрагмента брадикинина (1-7) (б) , приготовленный с Тап при различных температурах образца пластин.. Красные и синие данные указывают на образец, полученный при температуре образце пластины 25 и 5 ° С, соответственно.г "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Образец плиты Температура (° C) | Образец | Температура воздуха (° C) | Относительная влажность (RH%) | Время высыхания (сек) |
| 5 | мальтотриозу с Тап | 20 ± 3 | <25 | 800 - 1000 |
| фрагмент брадикинин (1-7) с Тап | ||||
| 25 | мальтотриозу с Тап | 25 ± 3 | 100 - 150 | |
| фрагмент брадикинин (1-7) с Тап |
Таблица 1: Экспериментальные параметры и условия сушки при различных температурах образца пластины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На основе предыдущих теоретических предсказаний, температуры, вызванной гидродинамические потоки внутри капель может преодолеть внешние капиллярные потоки, вызванные испарением растворителя. Эффективность такого внутренней рециркуляции молекул усиливается, когда градиенты температуры в пределах увеличения капелек. В соответствии с прогнозируемыми результатами, при поддержании температуры образца пластины при 5 ° С, поддерживая его окрестности при температуре окружающей среды, средняя скорость потока рециркуляции внутри капелькой примерно в 4 раза быстрее, чем у внешних потоков капилляра. Если температура образца пластины такой же, как в среде, то средняя скорость потока рециркуляции 1,800 раз медленнее, чем наружу капиллярного. Результаты этого расчета показывают, что снижение температуры пластинки образца во время приготовления образца является предпочтительным. Экспериментальные наблюдения согласуются с этим предсказанием.
Образец пластины нравратура должна точно контролироваться по всему образцу препарата процесса. В таблице 1 показано типичное время сушки капель с 0,1 мкл образца при различных температурах образца пластины. Перед нанесением раствора образца на пластине, важно, чтобы убедиться, что поверхность образца плиты высохнет. Если вода происходит конденсация при подготовке образцов при низких температурах, осаждение раствора образца не рекомендуется, так как конденсируется вода расширяет примеры областей и разбавляет решения. Таким образом, важно, чтобы сохранить относительную влажность сушильной камеры ниже 25%. Кроме того, при подготовке образцов при низких температурах, образец пластина должна быть теплой до комнатной температуры, прежде чем принимать его из сушильной камеры. Хотя незначительные конденсации воды после завершения кристаллизации образца не изменяет популяцию образца, значительная конденсация следует избегать.
Использование свежеприготовленных растворов предварительно перемешанных является рекопочинил. После того, как предварительно перемешанного растворы подвергаются воздействию воздуха, предварительно кристаллизаций растворов образцов происходят и конечный размер кристаллов и морфология может измениться. Таким образом, процедура пипеток должна быть выполнена с достаточной степенью эффективности, как правило, в течение 10 секунд, чтобы предотвратить капельку пробы с предварительной кристаллизации внутри наконечника пипетки. Рекомендуется наблюдать образцы морфологию под микроскопом, чтобы обеспечить подходящие кристаллические морфологию производятся перед анализом масс-спектрометрии. Если кристалл морфологию не так хороши, как и следовало ожидать, повторение процесса осаждения по мере необходимости.
По нашим теоретических и экспериментальных исследований, подготовки образцов с образцом пластины при низкой температуре, установленной в условиях окружающей среды значительно улучшает воспроизводимость и качество данных в MALDI-MS. Последующие эксперименты также показывают значительное повышение интенсивности сигнала с помощью данного способа приготовления образца. Экспериментальные данные, полученные с помощью тего метод значительно повысить надежность масс-спектров MALDI для количественного анализа. По сравнению с другими методами , включающими состава раствора или изменения свойств поверхности, 8,16-18 состояние меняется сушка проще и в более общем смысле применимо для обычных образцов. Таким образом, большинство пользователей масс-спектрометрии могут извлечь из этого пользу в обычных приложениях.
Улучшение MALDI гомогенность сигнала с понижением температуры образца пластины также эффективен для некоторых других популярных матриц. Например, улучшенная α-циклодекстрина (α-CD) сигнал гомогенности с Тап и альфа-циано-4-гидроксикоричной кислоты (CHCA) в качестве матрицы при низкотемпературных условиях образец сушки сообщалось в последнее время . 14 Недостатком изменяющемся образца пластины температура является то, что метод в настоящее время не подходит для анализа с высокой пропускной способностью из-за длительного времени сушки образца в условиях низких температур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) | Sigma-Aldrich | T64602 | |
| Bradykinin fragment (1-7) | Sigma-Aldrich | B1651 | |
| Maltotriose | Sigma-Aldrich | 47884 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 ml beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | this lab | ||
| Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) | this lab | ||
| MALDI-TOF stainless steel sample target | this lab |
References
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption. Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).
- Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).
- Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).
- Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).
- Hu, H., Larson, R. G. Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate. J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).
- Deegan, R. D., et al. Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
- Hu, H., Larson, R. G. Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions. J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).
- Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study. New J. Phys. 11, 075020 (2009).
- Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop. J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).
- Probstein, R. F. Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).
- Lai, Y. -H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).
- Hsiao, C. -H., et al. Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).
- Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation. Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).
- Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).
- Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting. Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).
