Introduction
Hartfalen is een complex klinisch syndroom, waarvan de symptomen zijn vermoeidheid, dyspnoe, inspanningsintolerantie en vochtophoping in perifere weefsels. Het is de belangrijkste doodsoorzaak in de ontwikkelde landen 1. Naast erfelijke cardiomyopathie veroorzaakt door mutaties in sarcomeer eiwitten of ionkanalen 2, kan myocardiale disfunctie veroorzaakt door een verscheidenheid aan medische aandoeningen, waaronder hypertensie, hartklepaandoeningen, obesitas en diabetes 3. Veranderingen in het myocard structuur, elektrische geleiding en energiemetabolisme leiden tot onvoldoende cardiale pompcapaciteit om de bloedsomloop eisen, wat uiteindelijk resulteert in hartfalen 3,4 ontmoeten. De mechanismen die ten grondslag liggen hartfalen derhalve kritisch op het gebied van cardiovasculair onderzoek. Het identificeren moleculaire mechanismen die leiden tot hartfalen progressie uiteindelijk helpen bij de ontdekking van nieuwe therapeutische doelwitten of nuttig biomerkers
Cardiale hypertrofie en remodellering speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van hartfalen. Hypertensieve hart-en vaatziekten is de belangrijkste bijdragende factor van cardiale hypertrofie en de onaangepaste remodeling gezien bij menselijke patiënten 1. Om deze menselijke omstandigheden na te bootsen, zijn diermodellen vaak vastgesteld door middel van chirurgische procedures. In het bijzonder kan de dwars- of abdominale aorta wordt vernauwd tot de weerstand tegen de linker ventrikel, wat uiteindelijk leidt tot een drukoverbelasting in het hart te verhogen. Dit verschijnsel leidt gewoonlijk tot cardiale hypertrofie, een fysiologische compensatie van de hartspiercellen op de functionele eis van het cardiovasculaire systeem. Echter, de functionele vraag voorrang op de normale fysiologische compensatiemechanismen, wat leidt tot cardiale fibrose en contractegel impairment. Dwarse aorta vernauwing (TAC) chirurgie gaat vaak ingewikkelde procedures, waaronder thoracotomie, mechanische ventilatie en scheiding van de thymus en vetweefsel van de aortaboog. Daarentegen abdominale aorta vernauwing vereist eenvoudiger experimentele technieken 6-8. De abdominale aorta tussen het linker en rechter nierslagaders vernauwd tijdens de operatie. Cardiale hypertrofie en remodellering kan enkele weken waargenomen na de abdominale aorta vernauwing chirurgie 6-8; zij produceren robuuste hypertensieve hartziekte vergelijkbaar met die die door de dwarse aorta vernauwing chirurgie 9,10. We beschrijven hier een protocol abdominale aorta vernauwing gedrag in ratten een efficiënt, zeer reproduceerbare en minimaal-invasieve methode. De abdominale aorta naast de nierslagaders vernauwd door een 0,72 mm lus gevormd door een 4-0 zijden draad. Tien weken na de operatie, cardiale hypertrofie en remodeling waarneembaar. Het rattenmodel van abdominale aorta-vernauwing geïnduceerde cardiale hypertrofie verschaft een platform voor het bestuderen van ziektemechanismen en pathofysiologie, alsook de ontwikkeling van potentiële therapeutica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, gepubliceerd door het Amerikaanse National Institutes of Health (NIH publicatie nr. 85-23, herzien 1996). Dit protocol werd goedgekeurd door en in overeenstemming met de uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite bij National Taiwan University richtlijnen.
1. Dierlijke Surgery
- Bereid een 22 G injectienaald door afstomping de punt van de naald op een honen steen. Met behulp van een tang, plicate de naald in een rechte hoek.
- Voor de operatie voorbereiden die nodig chirurgische instrumenten en materialen, evenals een herstelkooi. Autoclaaf alle instrumenten en chirurgisch materiaal voor gebruik.
- Handhaving van de ratten ongeveer 200 g en houd ze onder 12 uur licht / donker cycli bij een gecontroleerde temperatuur (21 ± 2 ° C) met vrije toegang tot voedsel en water. Ten minste 6 ratten in elke groep. Verdoven de ratten met pentobarbital(75 mg / kg in 0,5 ml, ip) of een ander geschikt anestheticum. Controleer de diepte van de anesthesie door het testen van de staart reflex.
OPMERKING: De afwezigheid van staart reflex is een indicator van geschikte anesthesie. - Plaats een rat in rugligging op een operatie platform met een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur te handhaven. Scheer de buikstreek van de rat met een dierlijk haar clipper en haar remover lotion chirurgische besmettingen te voorkomen. Schrob de netjes geschoren achterlijf met betadine of een andere reinigende reagens voor de operatie.
NB: Het is belangrijk om een steriel veld te houden gedurende de hele procedure. - Voeg een 2 cm incisie langs de middellijn van het abdomen met een scalpel. Met behulp van een fysiologische zoutoplossing, houden de buik orgel vochtig tijdens de operatie. Verplaats de spijsverteringsorganen voorzichtig opzij behulp watten de inferior vena cava dat ligt in het achterste peritoneale regio bloot. Identificeer de abdominale aorta, die ligt geplaatst naast en meestal aan delinks van de inferior vena cava.
NB: De abdominale aorta is het schip dat pulseert in de tijd met de hartslag. - Doorboren het peritoneum met een tang om de schepen eronder bloot. Voorzichtig de abdominale aorta nabij de nierslagaders isoleren en passen een 8 cm lange 4-0 zijden hechtdraad onder de abdominale aorta tussen de oorsprong van de rechter en linker nierslagaders.
- Maak een losse dubbele knoop met de hechtdraad; laat een diameter lus 3 mm, en plaats de afgestompte en boog 22 G naald in de lus. Draai de knoop rond de aorta en de naald en verwijder de naald onmiddellijk tot een diameter vernauwing 0,7 mm te bereiken.
- Sluit de buikholte met 6-0 absorbeerbare hechtmateriaal. Hecht de spier of incisies met eenvoudige onderbroken hechtingen. Om infectie te voorkomen, scrub de chirurgische site met een jodium tinctuur.
- Observeer het dier voorzichtig tot het voldoende bewustzijn herwint, zoals aangegeven door het vrije verkeeren voedselinname. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Om te voorkomen na de operatie pijn, de behandeling van de rat met acetaminofen (300 mg / kg in 0,5 ml, ip).
OPMERKING: Gebruikers moeten analgetica toedienen, zoals goedgekeurd door institutionele beleid.
2. Tissue and Blood Sample Collection
- Op 10 weken na de operatie, wegen de rat en verdoven met pentobarbital (75 mg / kg in 0,5 ml, ip). Voor de operatie, bevestigen de diepte van de anesthesie door het testen van zijn staart reflex. Plaats de rat op een metalen dienblad.
- Voeg een 2 cm incisie langs de middellijn van de hals met een scalpel. Verplaats de spieren voorzichtig met een tang om de luchtpijp bloot. Observeer aandachtig naar de halsslagaders, die parallel aan de luchtpijp zijn en pulseren in de tijd met de hartslag te identificeren.
- Verzamel het bloed van de halsslagader in een Bloedverzamelinrichting buis bekleed met EDTA. onmiddellijk centrifugehet bloed gedurende 15 minuten bij 2000 xg en het verzamelen van het plasma. Bewaar het bloedplasma bij -80 ° C totdat het nodig is.
- Maak een 5 cm incisie in de thoracale regio, rond de middellijn van xyphoid proces. Doorboren het membraan met scherpe tang. Met behulp van een schaar, knippen en verwijder de ribbenkast langs de mid-claviculaire lijnen aan beide zijden naar het hart bloot te leggen. Accijnzen het hart voorzichtig langs de cardiale en vasculaire grenzen. Verwijder het hart voorzichtig zonder grijpen het weefsel.
- Monteer het hart op een gemodificeerde Langendorff perfusie apparaat door koppelverkoop de aorta stam naar de perfusie naald. Perfuseren het hart met Krebs buffer (die 110 mM NaCl, 2,6 mM KCI, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, en 11 mM glucose [pH 7,4]) uit te spoelen het bloed. Weeg het hart en het berekenen van de hart-weight-to-body-gewichtsverhouding. Bevestig het hart met 4% paraformaldehyde op het ijs. Vergeet niet om een masker te dragen, omdat paraformaldehyde damp is toxic.
3. Tissue Fibrosis Kwantificering
- Plaats het paraformaldehyde gefixeerd hartweefsel op een weefsel snijden en snij inrichting 2 mm dikke panelen. Plaats de weefselcoupes per inbedding cassette. Dehydrateer het weefsel door een reeks van gegradeerde alcohol baden (50%, 75%, 95% en 100% voor 1 uur elk).
- Infiltreren het weefsel met xyleen gedurende 1 uur en tenslotte in was gedurende 1 uur. Plaats het geïnfiltreerde weefsel in een inbedding cassette en insluiten met paraffine. Bewaar de ingebedde weefsels in paraffine blokken bij kamertemperatuur totdat microtoming.
- Snijd de ingebedde weefsel in 4 pm dikke secties. Leg de secties in een 45 ° C waterbad. Dompel een glasplaatje in het waterbad onder een hoek en geleidelijk aan de aanpak van de paraffine sectie randen gedeeltelijke bevestiging aan de dia toe te staan.
- Beweeg de schuif in en uit het bad om potentiële luchtzakken onder het gedeelte weefsel te verwijderen en om een betere hechting te vergemakkelijken. droge tHij schuift bij 37 * C gedurende 1 uur en opgeslagen bij kamertemperatuur histologische kleuring.
- Zet de schuif in een tank. Deparaffinize de dia met xyleen gedurende 30 min en hydrateren in opeenvolgend verdunde alcohol (95%, 75% en 50% gedurende 3 min elk) en tenslotte in gedestilleerd water. Met adequate picrosirius rode oplossing volledig te bedekken de weefselcoupes gedurende 1 uur. Spoel de dia's in een 0,5% azijnzuur oplossing voor twee wijzigingen, en vervolgens uit te voeren twee spoelingen in absolute alcohol.
- Air-droog de glijbaan en monteer de dia in kunsthars met een dekglaasje. Fotografeer de dia in een zichtbaar licht veld.
LET OP: Het rode gebied in de foto toont een picrosirius rode positieve zone onder een microscoop bij 200X vergroting. Bereken het percentage positieve picrosirius rode zone boven de oppervlakte, wat aangeeft de mate van fibrose 11.
4. Bloed troponine kwantificering
- Kwantificeren plasma troponine niveausonder toepassing van een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Assay elk monster in duplo. Belasting 50 pl bloed plasma en 50 pl van een antilichaam cocktail in de geschikte putjes. Verzegel de plaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamer temperatuur op een plaat schudder bij 400 rpm.
OPMERKING: troponine in het plasma is een marker voor cardiale schade. - Zuig het vloeistof en was elk putje met 250 ui wasbuffer driemaal. Na de laatste wasbeurt, draai de plaat en dep het tegen schone papieren zakdoekjes om overmatige vloeistof te verwijderen.
- Voeg 100 pl tetramethylbenzidine substraat aan elk putje en incubeer gedurende 10 minuten in het donker op een plaat schudder bij 400 rpm. Voeg 100 gl stopoplossing aan elk putje. Schud de plaat op een plaat schudder gedurende 1 min mengen. Noteer de optische dichtheid (OD) bij 450 nm.
NB: De troponine-concentratie in verhouding staat tot de OD-waarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 weken na de abdominale aorta vernauwing chirurgie, werd de resulterende cardiale pathologie geanalyseerd. De cardiale histologie werd gemeten als de verhouding van het gewicht van het hart tot het lichaamsgewicht en door het detecteren van de hoeveelheid collageen in het hart. Cardiale schade werd bevestigd door meting van plasma cardiaal troponine concentratie.
Zoals getoond in figuur 1A, is de cardiale grootte vergrote abdominale aorta vernauwing chirurgie, zoals blijkt uit een hogere hart-gewicht-tot-lichaam gewichtsverhouding (Figuur 1B), een indicator van cardiale hypertrofie. Via picrosirius rode vlekken, kan fibrotische myocardium gekleurd met een verhoogd collageen (rood) worden onderscheiden van normale gebieden (geel, figuur 2). Cardiale fibrose verhoogd abdominale aorta vernauwing operatie (figuur 2B) in vergelijking met c ONTROLES (Figuur 2A). De resultaten correleren met plasma troponine concentraties (figuur 3). Een verhoogd troponine concentratie geeft aan dat cardiale remodeling en de schade tijdens de druk overbelasting heeft plaatsgevonden. Bij elkaar genomen, abdominale aorta vernauwing resulteert in evident cardiale letsels, gemarkeerd cardiale hypertrofie, en weefsel remodeling.
Figuur 1:. Cardiale Hypertrofie bij drukoverbelasting (A) Representatieve hart en (B) hart-gewicht-tot-lichaam gewichtsverhouding getoond 10 weken na abdominale aorta vernauwing chirurgie. Gegevens stellen het gemiddelde ± SEM van zes onafhankelijke experimenten uitgevoerd. Verschillen tussen groepen werden door de t-test van Student. * P <0,05 versus controle. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Cardiac Fibrosis tijdens drukoverbelasting.
Picrosirius rode vlekken onthuld verhoogde collageen expressie. (A) Representatieve picrosirius rode kleuring (Schaal bar = 200 urn) en (B) percentage fibrotische gebied 10 weken na abdominale aorta vernauwing chirurgie. Gegevens stellen het gemiddelde ± SEM van zes onafhankelijke experimenten uitgevoerd. Verschillen tussen groepen werden door de t-test van Student. * p <0,05 versus controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
s / ftp_upload / 54818 / 54818fig3.jpg "/>
Figuur 3: Cardiac verwondingen bij drukoverbelasting.
Bloedplasma troponine concentraties werden gemeten 10 weken na abdominale aorta vernauwing chirurgie. Gegevens stellen het gemiddelde ± SEM van zes onafhankelijke experimenten uitgevoerd. Verschillen tussen groepen werden door de t-test van Student. * p <0,05 versus controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
- Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 111, 131-150 (2012).
- Towbin, J. A.
- Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Dis Model Mech. 3, 138-143 (2010).
- van Bilsen, M., van Nieuwenhoven, F. A., van der Vusse, G. J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimental? Cardiovasc Res. 81, 420-428 (2009).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Gu, W. L., Chen, C. X., Huang, X. Y., Gao, J. P. The effect of angoroside C on pressure overload-induced ventricular remodeling in rats. Phytomedicine. 22, 705-712 (2015).
- Zhang, Y., et al. Alteration of cardiac ACE2/Mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol. 57, 335-342 (2014).
- Tardif, K., et al. Nestin upregulation characterizes vascular remodeling secondary to hypertension in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1265-H1274 (2015).
- Li, C., et al. Myeloid mineralocorticoid receptor deficiency inhibits aortic constriction-induced cardiac hypertrophy in mice. PLoS One. 9, e110950 (2014).
- Ku, H. C., Su, M. J. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PLoS One. 9, e85634 (2014).
- Lee, S. Y., et al. Caffeic acid ethanolamide prevents cardiac dysfunction through sirtuin dependent cardiac bioenergetics preservation. J Biomed Sci. 22, 80 (2015).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. J Vis Exp. , e50983 (2014).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Schaefer, A., et al. A New Animal Model for Investigation of Mechanical Unloading in Hypertrophic and Failing Hearts: Combination of Transverse Aortic Constriction and Heterotopic Heart Transplantation. PLoS One. 11, e0148259 (2016).
- Rodriguez-Iturbe, B., Quiroz, Y., Kim, C. H., Vaziri, N. D. Hypertension induced by aortic coarctation above the renal arteries is associated with immune cell infiltration of the kidneys. Am J Hypertens. 18, 1449-1456 (2005).
- Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of Caffeic Acid with Pyrrolidine Enhances Antioxidant Ability by Activating AKT/HO-1 Pathway in Heart. PLoS One. 11, e0148545 (2016).
- Bovill, J. G. Intravenous anesthesia for the patient with left ventricular dysfunction. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 10, 43-48 (2006).
- Inoko, M., Kihara, Y., Morii, I., Fujiwara, H., Sasayama, S. Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats. Am J Physiol. 267, H2471-H2482 (1994).
- Heyen, J. R., et al. Structural, functional, and molecular characterization of the SHHF model of heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1775-H1784 (2002).
