Introduction
L'insuffisance cardiaque est un syndrome clinique complexe, dont les symptômes incluent la fatigue, dyspnée, intolérance à l'exercice, et la rétention d'eau dans les tissus périphériques. Elle est la principale cause de décès dans les pays développés 1. En dehors de la cardiomyopathie héréditaire causée par des mutations dans les protéines de sarcomère ou des canaux ioniques 2, la dysfonction myocardique peut être due à une variété de maladies, y compris l' hypertension, les maladies cardiaques valvulaires, l' obésité et le diabète 3. Les changements dans la structure du myocarde, la conduction électrique, et le métabolisme énergétique conduisent à une capacité de pompage cardiaque insuffisant pour répondre aux exigences de la circulation, ce qui se traduit en fin de compte dans l' insuffisance cardiaque 3,4. L'étude des mécanismes sous-jacents d'insuffisance cardiaque, par conséquent, il est essentiel dans le domaine de la recherche cardiovasculaire. Identifier les mécanismes moléculaires conduisant à la progression de l'insuffisance cardiaque peut éventuellement aider à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques ou des biomarqueurs utiles
L'hypertrophie cardiaque et le remodelage joue un rôle essentiel dans le développement de l'insuffisance cardiaque. Maladie cardiaque hypertensive est le facteur contributif clé de l' hypertrophie cardiaque et le remodelage mésadapté observé chez les patients humains 1. Pour imiter ces conditions humaines, les modèles animaux sont souvent établis par des procédures chirurgicales. En particulier, l'aorte abdominale ou transversale peut être rétrécie pour accroître la résistance contre le ventricule gauche, ce qui conduit finalement à une surcharge de pression dans le coeur. Ce phénomène se traduit généralement par une hypertrophie cardiaque, une compensation physiologique des cardiomyocytes pour répondre à la demande de fonctionnement du système cardio-vasculaire. Cependant, la demande fonctionnelle remplace les mécanismes compensatoires physiologiques normaux, conduisant à la fibrose cardiaque et contracaltération de la tuile. Transverse constriction aortique (TAC) chirurgie implique souvent des procédures complexes, y compris thoracotomie, ventilation mécanique, et la séparation du thymus et des tissus adipeux de la crosse aortique. En revanche, la constriction de l' aorte abdominale nécessite des techniques expérimentales simples 6-8. L'aorte abdominale, entre les artères rénales droite et gauche, est resserrée au cours de l'intervention chirurgicale. L' hypertrophie cardiaque et le remodelage peut être observé à plusieurs semaines après l'opération de rétrécissement de l' aorte abdominale 6-8; ils produisent une maladie hypertensive robuste cardiaque similaire à celui généré par la chirurgie de la constriction aortique transverse 9,10. Ici, nous décrivons un protocole pour effectuer la constriction de l'aorte abdominale chez les rats en utilisant une méthode efficace, hautement reproductible et peu invasive. L'aorte abdominale à proximité des artères rénales est resserrée par une boucle à 0,72 mm formé par un fil de soie 4-0. Dix semaines après la chirurgie, l'hypertrophie cardiaque et remodeling peut être observée. Le modèle de rat de l'hypertrophie de l'aorte abdominale induite par une constriction cardiaque fournit une plate-forme pour l'étude des mécanismes de la maladie et la physiopathologie, ainsi que le développement de thérapies potentielles.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire, publiée par le National Institutes of Health (NIH publication no. 85-23, révisée en 1996). Ce protocole a été approuvé par et en conformité avec les lignes directrices énoncées par le Institutional Animal Care et utilisation Comité à l'Université nationale de Taiwan.
1. Chirurgie animale
- Préparer un G aiguille 22 de la seringue par émousser la pointe de l'aiguille sur une pierre à aiguiser. En utilisant des pinces, plicate l'aiguille à un angle droit.
- Avant la chirurgie, préparer les instruments chirurgicaux et les matériaux nécessaires, ainsi que d'une cage de récupération. Autoclave tous les instruments et les fournitures chirurgicales avant utilisation.
- Maintenir les rats autour de 200 g et de les garder sous 12 h cycles lumière / obscurité à une température contrôlée (21 ± 2 ° C) avec un accès libre à la nourriture et de l'eau. Inclure au moins 6 rats dans chaque groupe. Anesthésier les rats avec du pentobarbital(75 mg / kg dans 0,5 ml, ip) ou d'un autre agent anesthésique approprié. Confirmer la profondeur de l'anesthésie en testant la queue réflexe.
NOTE: L'absence de réflexe caudal est un indicateur de l'anesthésie adéquate. - Placer un rat en décubitus dorsal sur une plate-forme d'intervention avec un coussin chauffant pour maintenir la température du corps. Rasez la région abdominale du rat avec une tondeuse à poils et les cheveux lotion démaquillante pour éviter les contaminations chirurgicales. Frotter l'abdomen proprement rasé avec de la bétadine ou un autre réactif de nettoyage avant la chirurgie.
NOTE: Il est important de maintenir un champ stérile tout au long de la procédure. - Faire une incision de 2 cm le long de la ligne médiane de l'abdomen avec un scalpel. En utilisant une solution saline normale, maintenir l'organe abdominal humide pendant la chirurgie. Déplacer les organes digestifs soigneusement sur le côté en utilisant des balles de coton pour exposer la veine cave inférieure qui se trouve dans la région du péritoine postérieur. Identifier l'aorte abdominale, qui se trouve juxtaposée à et généralement sur laà gauche de la veine cave inférieure.
NOTE: L'aorte abdominale est le vaisseau qui palpite dans le temps avec le rythme cardiaque. - Pierce le péritoine avec une paire de pinces pour découvrir les vaisseaux sous. isoler doucement l'aorte abdominale à côté des artères rénales et passer un 8 cm de long 4-0 suture de soie sous l'aorte abdominale entre les origines de la droite et les artères rénales gauche.
- Faire un double noeud lâche avec la suture; laisser une boucle de 3 mm de diamètre, et placer l'aiguille 22 G émoussée et pliée à l'intérieur de la boucle. Serrez le noeud autour de l'aorte et l'aiguille, puis retirez immédiatement l'aiguille pour atteindre un diamètre de constriction de 0,7 mm.
- Fermez la cavité abdominale avec 6-0 matériel de suture absorbable. Suturer les muscles ou la peau incisions avec des sutures interrompues simples. Pour prévenir l'infection, frottez le site chirurgical avec une teinture d'iode.
- Observer l'animal avec soin jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience suffisante, comme indiqué par la libre circulationet l'apport alimentaire. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Pour prévenir la douleur post-opératoire, traiter le rat avec de l'acétaminophène (300 mg / kg dans 0,5 ml, ip).
REMARQUE: Les utilisateurs doivent administrer des analgésiques comme approuvé par les politiques institutionnelles.
2. tissus et du sang de prélèvement des échantillons
- A 10 semaines post-chirurgie, peser le rat et anesthésier avec du pentobarbital (75 mg / kg dans 0,5 ml, ip). Avant la chirurgie, confirmer la profondeur de l'anesthésie en testant sa queue réflexe. Placez le rat sur un plateau métallique.
- Faire une incision de 2 cm le long de la ligne médiane du cou à l'aide d'un scalpel. Décaler les muscles soigneusement avec une pince pour exposer la trachée. Observer attentivement pour identifier les artères carotides, qui sont parallèles à la trachée et pulsent dans le temps avec le rythme cardiaque.
- Recueillir le sang de l'artère carotide dans un tube de collecte de sang revêtu d'EDTA. Immédiatement centrifugeusele sang pendant 15 minutes à 2000 x g et à recueillir le plasma. Stocker le plasma sanguin à -80 ° C jusqu'à leur utilisation.
- Faire un 5 cm incision à la région thoracique, autour de la ligne médiane du processus xiphoïde. Percer la membrane avec une pince coupants. En utilisant une paire de ciseaux, couper et enlever la cage thoracique le long des lignes mi-claviculaire des deux côtés pour exposer le cœur. Exciser le coeur soigneusement le long des frontières cardiaques et vasculaires. Retirez le cœur en douceur, sans saisir le tissu.
- Monter le coeur sur un appareil de perfusion de Langendorff modifié en liant le tronc aortique à l'aiguille de perfusion. Perfuser le cœur avec du tampon Krebs (contenant du NaCl 110 mM, 2,6 mM de KCl, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 25 mM de NaHCO 3 et du glucose 11 mM [pH 7,4]) pour rincer le sang. Peser le cœur et le calcul du ratio coeur-poids-poids corporel. Fixer le coeur avec 4% de paraformaldehyde sur la glace. Rappelez-vous de porter un masque, car la vapeur d'paraformaldéhyde est toxic.
3. Tissue Fibrose Quantification
- Placez le tissu cardiaque paraformaldehyde fixé sur un dispositif de sectionnement de tissu et couper 2 mm sections épaisses. Placer les coupes de tissus dans une cassette enrobage. Déshydrater le tissu à travers une série de bains d'alcool graduées (50%, 75%, 95% et 100% pendant 1 heure chacun).
- Infiltrer le tissu avec du xylène pendant 1 h et enfin dans la cire pendant 1 h. Placez le tissu infiltré dans une cassette intégration et d'intégrer avec de la cire de paraffine. Conserver les tissus intégrés dans des blocs de paraffine à température ambiante jusqu'à microtome.
- Trancher le tissu incorporé dans 4 sections um d'épaisseur. Placez les sections dans un bain d'eau à 45 ºC. Trempez une lame de verre dans le bain d'eau à un angle et approcher progressivement les bords de la section de paraffine pour permettre la fixation partielle à la diapositive.
- Déplacez le curseur dans et hors de la salle de bain pour éliminer les poches d'air potentielles sous la coupe de tissu et de faciliter une meilleure fixation. Dry til glisse à 37 ° C pendant 1 heure et les stocker à température ambiante pour la coloration histologique.
- Mettre la diapositive dans un réservoir. Déparaffiner la lame avec du xylène pendant 30 min et réhydrater dans séquentiellement l'alcool dilué (95%, 75% et 50% pendant 3 minutes à chaque fois) et enfin dans de l'eau distillée. Utiliser une solution rouge picrosirius suffisante pour couvrir complètement les coupes de tissus pendant 1 h. Rincer les lames dans une solution d'acide acétique à 0,5% pour les deux changements, puis effectuer deux rinçages dans l'alcool absolu.
- Air-sécher la glissière et monter la glissière en résine synthétique avec une lamelle. Photographier la lame dans un champ de lumière visible.
NOTE: La zone rouge sur la photo montre une zone rouge positif picrosirius sous un microscope à grossissement de 200x. Calculer le pourcentage de la zone rouge positif picrosirius sur la superficie totale, ce qui indique l'étendue de la fibrose 11.
4. Sang Troponin Quantification
- Quantifier les niveaux de troponine de plasmaen utilisant un dosage immuno-enzymatique (ELISA). Doser chaque échantillon en double. Charge 50 ul de plasma sanguin et de 50 ul d'un cocktail d'anticorps dans les puits appropriés. Sceller la plaque et incuber pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur de plaque à 400 rpm.
NOTE: La troponine cardiaque dans le plasma est un marqueur de lésion cardiaque. - Aspirer le liquide et laver chaque puits avec 250 pi de tampon de lavage à trois reprises. Après le dernier lavage, retourner la plaque et épongez contre des serviettes en papier propre pour éliminer l'excès de liquide.
- Ajouter 100 pi de substrat de tétraméthylbenzidine à chaque puits et incuber pendant 10 min dans l'obscurité sur un agitateur de plaque à 400 rpm. Ajouter 100 ul de solution d'arrêt à chaque puits. Agiter la plaque sur un agitateur de plaque pendant 1 min à mélanger. Notez la densité optique (DO) à 450 nm.
NOTE: La concentration de troponine est proportionnelle à la valeur de DO.
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Representative Results
10 semaines après l'opération de rétrécissement de l'aorte abdominale, de la pathologie cardiaque résultant a été analysé. L'histologie cardiaque a été mesurée en calculant le rapport du poids du cœur au poids corporel et en détectant la quantité de collagène dans le coeur. lésion cardiaque a été confirmée par la mesure de la concentration plasmatique de la troponine cardiaque.
Comme cela est représenté sur la figure 1A, la taille cardiaque a été agrandie après une opération de rétrécissement de l' aorte abdominale, comme le démontre un rapport supérieur à coeur poids à poids corporel (figure 1B), un indicateur de l' hypertrophie cardiaque. En utilisant picrosirius coloration rouge, myocardique fibrotique colorées avec une teneur en collagène accrue (rouge) peut être distingué des zones normales (jaune, figure 2). La fibrose cardiaque a augmenté après l' opération de rétrécissement de l' aorte abdominale (figure 2B) par rapport à c CONTRÔLES (figure 2A). Les résultats sont en corrélation avec les concentrations de troponine de plasma (figure 3). Une concentration de troponine accrue indique que le remodelage cardiaque et des blessures en cas de surcharge de pression est produite. Pris ensemble, les résultats de l'abdomen constriction aortique dans la lésion cardiaque évidente, marqué l'hypertrophie cardiaque et le remodelage tissulaire.
Figure 1:. Hypertrophie cardiaque pendant une surcharge de pression (A) coeur représentant et (B) rapports-coeur-poids à-poids corporel sont présentés 10 semaines après la chirurgie de constriction de l' aorte abdominale. Les données représentent la moyenne ± ESM de six expériences indépendantes réalisées. Les différences entre les groupes ont été évaluées par le test t de Student. * P <0,05 par rapport au témoin. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Fibrose cardiaque pendant une surcharge de pression.
Picrosirius coloration rouge a révélé une expression accrue de collagène. (A) picrosirius Représentant coloration rouge (barre d' échelle = 200 um) et (B) pourcentage de la superficie fibrotique 10 semaines après la chirurgie de constriction de l' aorte abdominale. Les données représentent la moyenne ± ESM de six expériences indépendantes réalisées. Les différences entre les groupes ont été évaluées par le test t de Student. * p <0,05 par rapport au témoin. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3: lésion cardiaque au cours de surcharge de pression.
Les concentrations de troponine de plasma sanguin ont été mesurées à 10 semaines après l'opération de rétrécissement de l'aorte abdominale. Les données représentent la moyenne ± ESM de six expériences indépendantes réalisées. Les différences entre les groupes ont été évaluées par le test t de Student. * p <0,05 par rapport au témoin. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
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