Introduction
심장 장애는 말초 조직에서의 피로, 호흡 곤란을 포함하는의 증상이, 편협 운동 복잡한 임상 증후군, 및 체액 저류이다. 그것은 선진국 (1) 사망의 주요 원인이다. 이외에도 근절 단백질 또는 이온 채널이 돌연변이에 의한 유전 심근증, 심근 기능 부전, 고혈압, 판막 심장 질환, 비만, 당뇨병 및 3을 포함하는 의료 조건의 다양한 의해 야기 될 수있다. 부적절한 심장 펌핑 용량 심근 구조, 전기 전도 및 에너지 대사 리드의 변화는 궁극적으로 심장 마비 3,4 결과 순환 요구를 충족합니다. 심부전의 기초가되는 메카니즘을 연구 따라서 심혈관 연구 분야에서 매우 중요하다. 심부전의 진행으로 이어지는 분자 메커니즘을 식별하는 것은 궁극적으로 신규 한 치료 표적 또는 유용한 바이오 마커의 발견에 도움이 될 수있다
심장 비대 및 리모델링 심부전의 개발에 중요한 역할을한다. 고혈압 성 심장 질환, 심장 비대 및 인간 환자 1에서 보이는 부적응 리모델링의 주요 기여 요인이다. 이러한 인간의 조건을 모방하기 위해 동물 모델은 종종 수술을 통해 설정됩니다. 특히, 횡 방향 또는 복부 대동맥 궁극적 중심부의 압력 과부하를 초래 좌심실에 대한 저항을 증가 수축 될 수있다. 이 현상은 일반적으로 심장 비대에서, 심근 세포의 생리 보상 심장 혈관 시스템의 기능적 요구에 부응 할 결과. 그러나, 기능적인 수요가 심장 섬유증 및 contrac로 이어지는 정상 생리 보상 메커니즘을 대체타일 손상. 가로 대동맥 수축 (TAC) 수술은 종종 대동맥 궁에서 개흉술, 기계 환기 및 흉선의 분리 및 지방 조직을 포함하는 복잡한 절차를 포함한다. 반면, 복부 대동맥 협착은 간단한 실험 방법 6-8이 필요합니다. 복부 대동맥은 좌우 신장 동맥 사이 수술 동안 수축된다. 심장 비대 및 리모델링은 복부 대동맥 수축 수술 6-8 후 몇 주를 관찰 할 수있다; 그들은 횡 대동맥 협착 수술 9,10 의해 생성 된 것과 유사한 강력한 고혈압 심장병을 생산한다. 여기서, 우리는 효율적인 높은 재현성하고 최소한의 침습적 인 방법을 이용하여 쥐의 복부 대동맥 수축을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 신장 동맥에 인접한 복부 대동맥은 4-0 실크 스레드에 의해 형성된 0.72 mm 루프에 의해 수축된다. 텐 주 수술, 심장 비대 및 remodelin 후g가 관찰 될 수있다. 복부 대동맥 수축 유도 심비대의 래트 모델은 질병 및 병태 생리 메커니즘뿐만 아니라, 잠재적 인 치료제의 개발 연구를위한 기반을 제공한다.
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Protocol
모든 동물 실험은 미국 국립 보건 연구소에 의해 게시 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 (NIH 간행물 없습니다. 85-23가 1996 년 개정)에 따라 실시 하였다. 이 프로토콜은에 의해 국립 대만 대학에서 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침에 따라 승인을 받았다.
1. 동물 수술
- 호닝 돌에 바늘의 끝을 둔화로 22 G 주사기 바늘을 준비합니다. 집게를 사용하여 직각으로 니들 plicate.
- 수술 전에 필요한 수술기구 및 재료뿐만 아니라 회복 케이지를 준비한다. 사용하기 전에 모든 장비 및 수술 공급을 압력솥.
- 200g의 주위에 쥐를 유지하고 음식과 물을 무료로 액세스 할 수있는 제어 온도 (21 ± 2 ° C)에서 12 시간 빛 / 어둠 사이클에서 보관하십시오. 각 그룹에서 최소 6 마리를 포함합니다. 펜토 바르 비탈로 쥐를 마취또는 다른 적절한 마취제 (0.5 ml의 IP를 75 ㎎ / ㎏). 꼬리 반사를 테스트하여 마취의 깊이를 확인합니다.
참고 : 꼬리 반사의 부재는 적절한 마취의 지표입니다. - 체온을 유지하기 위해 가열 패드와 수술 플랫폼 앙와위에서 쥐를 놓는다. 수술 오염을 방지하기 위해 동물 이발기 헤어 리무버 로션 래트의 복부를 면도. betadine 또는 수술 전에 다른 클렌징 시약으로 깔끔하게 면도 복부를 문질러.
참고 :이 절차를 통해 멸균 필드를 유지하는 것이 중요하다. - 메스와 복부의 정중선을 따라 2cm의 절개를합니다. 생리 식염수를 사용하여 수술 중 습기 복부 기관을 유지합니다. 후방 복막 영역에 놓여 하대 정맥을 노출 면봉을 사용하여 측면을주의 깊게 소화 기관을 대체. 온 일반적으로 병렬 및 거짓말 복부 대동맥을 확인대정맥의 왼쪽.
주 : 복부 대동맥은 심장 박동에 맞춰 맥동 용기이다. - 아래의 혈관을 밝히기 위해서 집게 한 쌍의 복막을 관통. 부드럽게 신장 동맥에 인접한 복부 대동맥을 분리하고, 오른쪽의 기원과 왼쪽 신장 동맥 사이의 복부 대동맥 아래 8 CM-긴 4-0 실크 봉합사를 전달합니다.
- 봉합사와 느슨한 두 번 매듭을 확인; 3 mm 직경의 루프를두고 루프 내부의 무딘 구부러진 22 G 바늘을 배치합니다. 대동맥과 바늘 주위의 매듭을 체결 한 후 0.7 mm 직경의 수축을 달성하기 위해 즉시 바늘을 제거합니다.
- 6-0 흡수성 봉합사 재료로 복강을 닫습니다. 간단한 중단 봉합과 근육이나 피부 절개를 봉합. 감염을 예방하기 위해, 요오드 팅크와 수술 부위 스크럽.
- 충분한 의식을 회복 할 때까지 자유 이동에 의해 표시된 바와 같이,주의 동물을 관찰음식 섭취. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 수술 후 통증을 방지하기 위해, 아세트 아미노펜 (0.5 ml를 300 ㎎ / ㎏, IP)와 쥐를 치료.
주 : 기관의 정책에 의해 승인 된 사용자 진통제를 관리해야합니다.
2. 조직과 혈액 샘플 컬렉션
- 십주 수술 후에서, 쥐의 무게 (0.5 ml의 IP를 75 ㎎ / ㎏)을 펜토 바르 비탈로 마취. 수술 전에 꼬리 반사를 테스트하여 마취의 깊이를 확인합니다. 금속 트레이에 쥐를 놓습니다.
- 메스를 사용하여 목의 정중선을 따라 2cm의 절개를합니다. 기관을 노출 집게로 조심스럽게 근육을 대체. 기관 평행 및 심박수에 맞춰 맥동 경동맥을 식별하기 위해주의 깊게 관찰한다.
- EDTA로 코팅 된 혈액 수집 관에 경동맥에서 피를 수집합니다. 즉시 원심 분리기2,000 XG에 15 분 동안 혈액과 플라즈마를 수집합니다. 필요할 때까지 -80 ° C에서 혈장을 저장합니다.
- xyphoid 과정의 중간 선 주위에, 흉부 영역에서 5cm의 절개를합니다. 날카로운 집게로 다이어프램을 관통. 가위를 사용하여 절단하고 심장을 노출 양쪽에 중반 쇄골 라인을 따라 흉곽을 제거합니다. 심장 및 혈관 국경을 따라 조심스럽게 마음을 절제. 조직을 잡아없이 부드럽게 마음을 제거합니다.
- 관류 바늘에 대동맥 트렁크를 묶는하여 수정을 Langendorff 관류 장치에 마음을 탑재합니다. 크렙스 버퍼 심장 관류 (110 mM의 염화나트륨, 2.6 밀리미터의 KCl을 포함하는 1.2 밀리미터 KH 2 PO 4, 1.2 mM의 황산, 25 mM의 NaHCO3을, 11 mM의 포도당 [산도 7.4]) 혈액을 씻어. 심장의 무게를 측정하고 심장 무게 - 투 - 몸 무게 비율을 계산한다. 얼음에 4 % 파라 포름 알데히드와 심장을 수정합니다. 파라 포름 알데히드 증기 TOX이기 때문에, 마스크를 착용 기억IC.
3. 조직 섬유증 정량
- 조직 절편 장치의 파라 포름 알데히드 고정 심장 조직을 놓고 2mm 두께 부분을 잘라. 매립 카세트에서 조직 섹션을 배치합니다. 등급 알코올 욕 (50 %, 75 %, 95 %, 1 시간마다, 100 %)의 일련의 조직을 탈수.
- 1 시간 동안 왁스에 마지막 1 시간 동안 자일 렌과 조직을 침투합니다. 매립 카세트에 침투 조직을 놓고 파라핀 왁스 포함. microtoming 때까지 실온에서 파라핀 블록에 포함 된 조직을 저장합니다.
- 4 μm의 두께 섹션으로 포함 된 조직을 조각입니다. 45 ºC 물을 욕조에 섹션을 놓습니다. 각도 수조에 유리 슬라이드를 담궈 서서히 슬라이드 부분 부착 있도록 파라핀 섹션 가장자리 접근.
- 에 슬라이드를 이동하고 화장실에서 조직 섹션에서 잠재적 인 공기 주머니를 제거하고 더 나은 부착을 용이하게 할 수 있습니다. 드라이 t그 1 시간 동안 37 ºC에서 슬라이드 조직 학적 염색을 실온에서 보관.
- 탱크에 슬라이드를 넣습니다. 30 분간 크실렌으로 슬라이드 Deparaffinize 최종적 증류수 (3 분마다 95 %, 75 %, 50 %)을 순차적으로 희석하여 알콜을 재수. 완전히 1 시간 동안 조직 섹션을 충당하기 위해 적절한 picrosirius 빨간 솔루션을 사용합니다. 두 변화 0.5 % 아세트산 용액에 슬라이드를 헹군 후 무수 알코올 두 헹굼을 수행한다.
- 슬라이드를 공기 - 건조 및 커버 슬립과 합성 수지에서 슬라이드를 탑재합니다. 가시 광선 필드에 슬라이드를 사진.
참고 : 사진에서 빨간색 영역은 200X 배율의 현미경 아래 picrosirius 빨간색 긍정적 인 영역을 보여줍니다. 섬유증 (11)의 정도를 나타내는 총 면적 위에 picrosirius 적색 양 영역의 비율을 계산한다.
4. 혈액 트로포 닌 정량
- 플라즈마 트로포 닌 농도를 정량화효소 결합 면역 분석법 (ELISA)을 사용. 중복 된 각 샘플을 분석. 로드 혈장 50 ㎕를 적절한 웰에 항체 칵테일 중 50 μL. 플레이트를 밀봉하고 400 rpm에서 플레이트 진탕 기에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
참고 : 플라즈마의 심장 트로포 닌은 심장 부상 마커입니다. - 액체를 대기음 및 세척 버퍼의 250 μl를 3 회 각 웰을 씻는다. 마지막 세척 후, 플레이트를 반전 과도한 액체를 제거하기 위해 깨끗한 종이 타월에 대해 그것을시킨다.
- 각 웰에 테트라 메틸 기판의 100 μl를 추가하고 400 rpm에서 접시 쉐이커에 어둠 속에서 10 분 동안 품어. 각 웰에 스톱 솔루션의 100 μl를 추가합니다. 1 분 혼합하는 접시 통에서 접시를 흔들어. 450 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 기록한다.
주 : 트로포 닌 농도가 OD 값에 비례한다.
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Representative Results
10주 복부 대동맥 협착 수술 후, 생성 된 심장 병리를 분석 하였다. 심장 조직학은 체중 심장 중량의 비를 계산함으로써 상기 중심 콜라겐의 양을 검출함으로써 측정 하였다. 심장 손상 플라즈마 심장 트로포 닌 농도를 측정함으로써 확인 하였다.
도 1a에 도시 된 바와 같이 높은 심장 중량에 차체 중량의 비율 (도 1b), 심장 비대의 지표에 의해 입증 된 바와 같이, 심장의 크기는, 복부 대동맥 협착 수술 후 확대 하였다. picrosirius 레드 염색을 이용함으로써, 증가 된 콜라겐 함유량 (적색)로 염색 심근 섬유증 정상 영역 (황색도 2)와 구별 될 수있다. C에 비하여 심근 섬유증은 복부 대동맥 협착 수술 (도 2B) 후에 증가 ontrols (그림 2A). 결과는 플라즈마 트로포 닌 농도 (도 3)와 상관 관계. 증가 된 트로포 닌 농도는 압력 과부하시 심장 리모델링과 상해가 발생했음을 나타냅니다. 함께, 분명 심장 부상에서 복부 대동맥 수축 결과, 심장 비대, 조직 리모델링을 표시했다.
그림 1 :. 압력 과부하시 심장 비대 (A) 대표 마음과 (B) 심장 무게 - 투 - 몸무게 비율은 십주 복부 대동맥 협착 수술 후 표시됩니다. 데이터는 수행 여섯 독립적 인 실험의 SEM ± 평균을 나타냅니다. 그룹 간의 차이는 학생의 t-시험으로 평가 하였다. * P <컨트롤 대 0.05. 8fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 압력 과부하시 심장 섬유증.
Picrosirius 빨간 염색이 증가 콜라겐 식을 밝혔다. (A) 대표 picrosirius 빨간색 염색 (스케일 바 = 200 μm의)과 십주 복부 대동맥 수축 수술 후 섬유 성 지역의 (B) 비율입니다. 데이터는 수행 여섯 독립적 인 실험의 SEM ± 평균을 나타냅니다. 그룹 간의 차이는 학생의 t-시험으로 평가 하였다. * P <0.05 제어 대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 : 압력 과부하시 심장 손상.
혈장 트로포 닌 농도 10주 복부 대동맥 협착 수술 후 측정 하였다. 데이터는 수행 여섯 독립적 인 실험의 SEM ± 평균을 나타냅니다. 그룹 간의 차이는 학생의 t-시험으로 평가 하였다. * P <0.05 제어 대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
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