Introduction
Сердечная недостаточность представляет собой сложный клинический синдром, симптомы которого включают усталость, одышка, непереносимость физической нагрузки, и задержка жидкости в периферических тканях. Это является основной причиной смерти в развитых странах 1. Помимо наследственной кардиомиопатией , вызванной мутацией в саркомера белков или ионных каналов 2, дисфункции миокарда может быть вызвано различными заболеваниями, в том числе гипертонии, клапанными пороками сердца, ожирение и сахарный диабет 3. Изменения структуры миокарда, электрической проводимости и энергетического обмена приводят к неадекватной сердечной мощности накачки для удовлетворения кровеносную требования, которые в конечном итоге приводит к сердечной недостаточности 3,4. Исследуя механизмы, лежащие в основе сердечной недостаточности, поэтому, имеет решающее значение в области сердечно-сосудистых исследований. Выявление молекулярных механизмов, приводящих к прогрессированию сердечной недостаточности в конечном итоге может помочь в обнаружении новых терапевтических мишеней или полезных биомаркеров
Сердечная гипертрофия и ремоделирование играет критическую роль в развитии сердечной недостаточности. Гипертоническая болезнь сердца является ключевым фактором , способствующим сердечной гипертрофии и неадекватные ремоделирования видели в человеческих пациентов 1. Для того, чтобы имитировать эти человеческие условия, животные модели часто создаются с помощью хирургических процедур. В частности, поперечное или брюшной аортой может быть сужен, чтобы увеличить сопротивление против левого желудочка, что в конечном итоге приводит к перегрузке давления в сердце. Это явление обычно приводит к гипертрофии сердца, физиологическое компенсация кардиомиоцитов для удовлетворения спроса функциональной сердечно-сосудистой системы. Тем не менее, функциональное требование переопределяет нормальных физиологических компенсаторных механизмов, что приводит к сердечной фиброза и Contracплитка обесценения. Поперечные Сужение аортального (ТАС) хирургическое вмешательство часто включает в себя сложные процедуры, в том числе торакотомии, механической вентиляции и разделения тимуса и жировой ткани от дуги аорты. В отличие от этого , брюшной аорты Сужение требует более простых экспериментальных методов 6-8. Брюшную аорту, между левой и правой почечной артерии, стягивается во время операции. Сердечная гипертрофия и ремоделирование может наблюдаться через несколько недель после того, как брюшной аорты стягивания операции 6-8; они производят надежные гипертоническая болезнь сердца , аналогичную порождена поперечным сужением аорты хирургии 9,10. Здесь мы опишем протокол для проведения брюшной аорты перетяжку у крыс с помощью эффективной, высоко-воспроизводимый, и минимально-инвазивным методом. Брюшной аорты рядом с почечных артерий сужен петлей на 0,72 мм, образованный 4-0 шелковой нитью. Через десять недель после операции, гипертрофия сердца и remodelinг может наблюдаться. Модель крысы брюшной аорты гипертрофии сердца, вызванной сужением обеспечивает платформу для изучения механизмов болезни и патофизиологии, а также развитие потенциальных терапевтических средств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованной в США Национальным институтом здоровья (NIH публикация №. 85-23, пересмотренным в 1996 г.). Этот протокол был утвержден и в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитета Национального университета Тайваня.
1. Животное хирургии
- Приготовьте 22 G иглу шприца путем притупление кончик иглы на бруска. Используя плоскогубцы, складчатые иглу под прямым углом.
- Перед хирургическим вмешательством, подготовить необходимые хирургические инструменты и материалы, а также клетку восстановления. Автоклав все инструменты и хирургические материалы перед использованием.
- Поддерживать крыс около 200 г и держать их под 12 ч свет / темнота циклов при контролируемой температуре (21 ± 2 ° С) со свободным доступом к пище и воде. Включите по крайней мере, 6 крыс в каждой группе. Обезболить крыс с фенобарбиталом(75 мг / кг в 0,5 мл, внутрибрюшинно) или другого подходящего анестетика. Подтвердите глубины анестезии путем тестирования хвост рефлекс.
Примечание: Отсутствие хвоста рефлекса является показателем адекватной анестезии. - Поместите крысу в положении лежа на спине на хирургической платформе с грелку для поддержания температуры тела. Бритье брюшной области у крыс с клипера животное волос и лосьон для удаления волос, чтобы избежать хирургических загрязнений. Скраб чисто выбритый живот с бетадин или другого очищающего реагента перед операцией.
Примечание: Важно поддерживать стерильную поле в течение всей процедуры. - Сделайте 2 см разрез по средней линии живота с помощью скальпеля. Используя физиологический раствор, держать в брюшной полости орган влажной во время операции. Смещать органы пищеварения тщательно к стороне, используя ватные шарики, чтобы выставить нижнюю полую вену, которая лежит в заднем брюшную область. Определить брюшной аорты, которая лежит смежное и, как правило, наслева от нижней полой вены.
ПРИМЕЧАНИЕ: брюшная аорта является судно, которое пульсирует в такт частоты сердечных сокращений. - Пирс брюшины с парой щипцов, чтобы раскрыть сосуды под ним. Осторожно изолируют брюшной аорты, прилегающих к почечных артерий и пройти 8 см длиной 4-0 шелковой нити под брюшной аорты между истоков правого и левого почечных артерий.
- Сделайте свободный двойной узел с шовного материала; оставить петлю диаметром 3 мм, и поместите притупляются и изогнутую 22 G иглы внутри цикла. Затянуть узел вокруг аорты и иглы, а затем удалить иглу сразу достичь перетяжку диаметром 0,7 мм.
- Закройте брюшной полости с 6-0 рассасывающиеся шовный материал. Шовный мышцы или кожи надрезы с простыми узловыми швами. Для того, чтобы предотвратить инфекцию, вычистить хирургический сайт с настойкой йода.
- Обратите внимание на животное тщательно до тех пор, пока вновь обретает достаточное сознание, как обозначено свободное перемещениеи потребление пищи. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Для того, чтобы предотвратить после операции боли, лечить крысу с ацетаминофена (300 мг / кг в 0,5 мл, внутрибрюшинно).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи должны вводить анальгетики, утвержденной институциональной политики.
2. ткани и крови для сбора проб
- Через 10 недель после операции, взвесьте крысу и обезболить его с фенобарбиталом (75 мг / кг в 0,5 мл, внутрибрюшинно). Перед хирургическим вмешательством, подтвердить глубину анестезии, проверяя его хвост рефлекс. Поместите крысу на металлический поднос.
- Сделайте 2 см разрез по средней линии шеи с помощью скальпеля. тщательно смещать мышцы с пинцетом, чтобы выставить трахею. Тщательно соблюдать для выявления сонной артерии, которые параллельны трахеи и пульсируют в такт частоты сердечных сокращений.
- Собирают кровь из сонной артерии в сбора крови трубки, покрытой ЭДТА. Сразу центрифугекровь в течение 15 мин при 2000 х г и собирают плазму. Хранить плазму крови при -80 ° C до тех пор, пока это необходимо.
- Сделайте 5 см разрез в в грудной области, вокруг средней линии мечевидный отросток. Пирс диафрагму с острыми щипцами. Используя пару ножниц, вырезать и удалить грудную клетку вдоль середины ключицы линий с обеих сторон, чтобы обнажить сердце. Вырежьте сердце тщательно вдоль сердца и сосудов границ. Удалите сердце осторожно, не захватывая ткани.
- Установите сердце на модифицированном перфузионной аппарата Лангендорфа, связывая аортальный ствол к перфузионной иглы. Заливать сердца с буфером Кребса (содержащий 110 мМ NaCl, 2,6 мМ KCl, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 1,2 мМ MgSO 4, 25 мМ NaHCO 3, и 11 мМ глюкозы [pH 7,4]) , чтобы смыть кровь. Взвесьте сердце и вычислить отношение сердца веса к массе тела. Закрепить сердце с 4% параформальдегид на льду. Не забудьте надеть маску, так как пара параформальдегид токсикодендронIC.
3. Ткань Фиброз Количественное
- Поместите параформальдегид фиксированной ткани сердца на секционирования устройстве ткани и вырезать толщиной 2 мм секции. Поместите срезы ткани в вложению кассете. Обезвоживает ткани через серию градуированных спиртовых ванн (50%, 75%, 95% и 100% в течение 1 ч каждый).
- Инфильтрат ткань с ксилолом в течение 1 ч и, наконец, в воске в течение 1 часа. Поместите пропитанную ткань в вложению кассету и вставлять парафином. Хранить не срезах тканей в парафиновые блоки при комнатной температуре до microtoming.
- Нарезать внедренный в ткань толщиной 4 мкм секций. Поместите секции в водяной бане при 45 ° С. Смочите предметное стекло в ванну с водой под углом и постепенно приближаться к парафином сечения ребра, чтобы позволить частичное присоединение к слайду.
- Переместить слайд в и из ванны, чтобы удалить возможные воздушные мешки под срез ткани и чтобы облегчить прикрепление. Сухие тон скользит при 37 ° С в течение 1 ч и хранить их при комнатной температуре в течение гистологического окрашивания.
- Поместите слайд в бак. Deparaffinize слайд с ксилолом в течение 30 мин и повторно гидратировать его в последовательно разбавленным спиртом (95%, 75%, и 50% в течение 3 мин каждый) и, наконец, в дистиллированной воде. Используйте адекватную picrosirius красный раствор, чтобы полностью покрыть срезы ткани в течение 1 часа. Промыть слайды в 0,5% растворе уксусной кислоты в течение двух изменений, а затем выполнить два полосканий в абсолютном спирте.
- Высушите слайд и смонтировать слайд в синтетической смолы с покровным. Сфотографировать слайд в видимом световом поле.
ПРИМЕЧАНИЕ: красная область на фотографии показана picrosirius красный положительной зоне под микроскопом при увеличении 200X. Рассчитывают процент picrosirius красной положительной зоне над общей площади, что свидетельствует о степени фиброза 11.
4. Кровь тропонина Количественное
- Количественно плазменные уровни тропонинас помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Пробирной каждого образца в двух экземплярах. Нагрузка 50 мкл плазмы крови и 50 мкл коктейля антител в соответствующие лунки. Уплотнение пластины и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере при 400 оборотах в минуту.
Примечание: Сердечный тропонин в плазме является маркером сердечной травмы. - Аспирируйте жидкость и промойте каждую лунку 250 мкл буфера для промывки три раза. После последней промывки пластину перевернули и промокните его против чистых бумажных полотенец, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Добавляют 100 мкл тетраметилбензидина субстрата в каждую лунку и инкубировать в течение 10 мин в темноте на шейкере при 400 оборотах в минуту. Добавьте 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Встряхнуть планшет на шейкере в течение 1 мин перемешать. Записывают оптическую плотность (OD) при 450 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация тропонина пропорциональна значению OD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Через 10 недель после абдоминальной хирургии аорты сужением, полученный в результате патологии сердца была проанализирована. Сердечный гистологии измеряли путем вычисления отношения веса сердца к весу тела и путем определения количества коллагена в сердце. Сердечный травма была подтверждена путем измерения плазменной концентрации сердечного тропонина.
Как показано на рисунке 1А, сердечный размер был увеличен после абдоминальной хирургии аорты стягивания, как показали более высоким отношением сердца веса к массе тела (рис 1B), индикатор гипертрофии сердца. При использовании picrosirius красное окрашивание, фиброзных миокард окрашивали с повышенным содержанием коллагена (красного цвета) можно отличить от нормальных областей (желтый, рисунок 2). Сердечный Фиброз был увеличен после абдоминальной хирургии сужением аорты (Фигура 2В) , по сравнению с C ontrols (Рисунок 2А). Результаты коррелируют с концентрацией в плазме тропонина (рисунок 3). Повышенная концентрация тропонина указывает на то, что сердечная ремоделирования и травмы во время перегрузки давления произошло. Взятые вместе, брюшного отдела аорты приводит Сужение в явной сердечной травмы, отмечены гипертрофию сердца и ремоделирования тканей.
Рисунок 1:. Гипертрофии сердца при перегрузке высокого давления (А) представитель сердца и (B) отношения сердца веса к массе тела показаны через 10 недель после абдоминальной хирургии аорты стягивания. Данные представляют собой средние значения ± SEM шести независимых экспериментов, выполненных. Различия между группами оценивали с помощью Т-критерия Стьюдента. * Р <0,05 в сравнении с контролем. 8fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Сердечный Фиброз во время перегрузки давления.
Picrosirius красное окрашивание показало повышенную экспрессию коллагена. (А) представитель picrosirius красное окрашивание (Шкала бар = 200 мкм) и (В) процент от фиброзной области через 10 недель после операции брюшной аорты стягивания. Данные представляют собой средние значения ± SEM шести независимых экспериментов, выполненных. Различия между группами оценивали с помощью Т-критерия Стьюдента. * р <0,05 в сравнении с контролем. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
s / ftp_upload / 54818 / 54818fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Сердечная Травмы во время перегрузки давления.
Концентрации тропонина в плазме крови измеряли через 10 недель после абдоминальной хирургии аорты стягивания. Данные представляют собой средние значения ± SEM шести независимых экспериментов, выполненных. Различия между группами оценивали с помощью Т-критерия Стьюдента. * р <0,05 в сравнении с контролем. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
- Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 111, 131-150 (2012).
- Towbin, J. A.
- Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Dis Model Mech. 3, 138-143 (2010).
- van Bilsen, M., van Nieuwenhoven, F. A., van der Vusse, G. J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimental? Cardiovasc Res. 81, 420-428 (2009).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Gu, W. L., Chen, C. X., Huang, X. Y., Gao, J. P. The effect of angoroside C on pressure overload-induced ventricular remodeling in rats. Phytomedicine. 22, 705-712 (2015).
- Zhang, Y., et al. Alteration of cardiac ACE2/Mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol. 57, 335-342 (2014).
- Tardif, K., et al. Nestin upregulation characterizes vascular remodeling secondary to hypertension in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1265-H1274 (2015).
- Li, C., et al. Myeloid mineralocorticoid receptor deficiency inhibits aortic constriction-induced cardiac hypertrophy in mice. PLoS One. 9, e110950 (2014).
- Ku, H. C., Su, M. J. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PLoS One. 9, e85634 (2014).
- Lee, S. Y., et al. Caffeic acid ethanolamide prevents cardiac dysfunction through sirtuin dependent cardiac bioenergetics preservation. J Biomed Sci. 22, 80 (2015).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. J Vis Exp. , e50983 (2014).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Schaefer, A., et al. A New Animal Model for Investigation of Mechanical Unloading in Hypertrophic and Failing Hearts: Combination of Transverse Aortic Constriction and Heterotopic Heart Transplantation. PLoS One. 11, e0148259 (2016).
- Rodriguez-Iturbe, B., Quiroz, Y., Kim, C. H., Vaziri, N. D. Hypertension induced by aortic coarctation above the renal arteries is associated with immune cell infiltration of the kidneys. Am J Hypertens. 18, 1449-1456 (2005).
- Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of Caffeic Acid with Pyrrolidine Enhances Antioxidant Ability by Activating AKT/HO-1 Pathway in Heart. PLoS One. 11, e0148545 (2016).
- Bovill, J. G. Intravenous anesthesia for the patient with left ventricular dysfunction. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 10, 43-48 (2006).
- Inoko, M., Kihara, Y., Morii, I., Fujiwara, H., Sasayama, S. Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats. Am J Physiol. 267, H2471-H2482 (1994).
- Heyen, J. R., et al. Structural, functional, and molecular characterization of the SHHF model of heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1775-H1784 (2002).
