Introduction
Hjärtsvikt är ett komplext kliniskt syndrom, symtom som trötthet, dyspné, träningsintolerans, och vätskeansamling i perifera vävnader. Det är den ledande dödsorsaken i de utvecklade länderna 1. Bortsett från ärftlig kardiomyopati orsakas av mutationer i sarcomere proteiner eller jonkanaler 2, kan hjärtsvikt orsakas av en mängd olika medicinska tillstånd, inklusive högt blodtryck, klaffsjukdomar, fetma och diabetes tre. Förändringar i hjärtmuskelstruktur, elektrisk ledning, och energiomsättning leder till bristande hjärtpumpkapaciteten för att möta cirkulations krav, vilket i slutändan leder till hjärtsvikt 3,4. Undersöka de mekanismer som ligger till grund för hjärtsvikt, därför, är kritisk inom området för kardiovaskulär forskning. Identifiera molekylära mekanismer som leder till hjärtsvikt progression så småningom kan underlätta upptäckten av nya terapeutiska mål eller användbara biomarkörer
Hjärthypertrofi och ombyggnad spelar en avgörande roll i utvecklingen av hjärtsvikt. Hypertensiv hjärtsjukdom är den viktigaste bidragande faktor av hjärthypertrofi och maladaptiv remodeling ses i humana patienter 1. Att efterlikna dessa mänskliga förhållanden, är djurmodeller ofta fastställas genom kirurgiska ingrepp. I synnerhet, kan den tvärgående eller bukaortan vara förträngd för att öka motståndet mot den vänstra ventrikeln, vilket i slutändan leder till en trycköverbelastning i hjärtat. Detta fenomen resulterar vanligtvis i hjärthypertrofi, att en fysiologisk ersättning av kardiomyocyter möta den funktionella efterfrågan av det kardiovaskulära systemet. Men åsidosätter funktionella efterfrågan de normala fysiologiska kompensationsmekanismer, vilket leder till hjärtfibros och Contrackakel njurfunktion. Tvär aorta sammandragning (TAC) kirurgi innebär ofta komplicerade förfaranden, inklusive torakotomi, mekanisk ventilation, och separation av bräss och fettvävnad från aortabågen. Däremot kräver abdominal aortic sammandragning enklare experimentella tekniker 6-8. Bukaortan, mellan de vänstra och högra njurartärerna, är förträngd under operationen. Hjärthypertrofi och remodellering kan observeras flera veckor efter den abdominala aorta sammandragning kirurgi 6-8; de producerar robust hypertensiv hjärtsjukdom liknande den som genereras av den tvärgående aorta sammandragning kirurgi 9,10. Här beskriver vi ett protokoll för att genomföra abdominal aortic sammandragning hos råttor med hjälp av ett effektivt, högt reproducerbar och minimalinvasiv metod. Bukaortan intill njurartärerna är förträngd av en 0,72 mm slinga som bildas av en 4-0 silkestråd. Tio veckor efter operationen, hjärthypertrofi och remodeling kan observeras. Modellen för abdominal aortic sammandragning inducerad hjärthypertrofi råtta ger en plattform för att studera mekanismer och patofysiologi sjukdom, liksom utvecklingen av potentiella läkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med handledningen för vård och användning av försöksdjur, publicerad av amerikanska National Institutes of Health (NIH publikation nr. 85-23, reviderad 1996). Detta protokoll har godkänts av och i enlighet med de riktlinjer som anges av Institutional Animal Care och användning kommittén vid National Taiwan University.
1. Animaliska Kirurgi
- Förbered en 22 G sprutnål genom avtrubbning spetsen av nålen på en brynsten. Med en tång, plicate nålen till en rät vinkel.
- Före operation, förbereda de nödvändiga kirurgiska instrument och material, samt en återhämtning bur. Autoklav alla instrument och kirurgisk utrustning före användning.
- Upprätthålla råttorna cirka 200 g och hålla dem under 12 timmar ljus / mörker-cykler vid en kontrollerad temperatur (21 ± 2 ° C) med fri tillgång till mat och vatten. Omfatta minst 6 råttor i varje grupp. Söva råttorna med pentobarbital(75 mg / kg i 0,5 ml, ip) eller ett annat lämpligt anestetiskt medel. Bekräfta djupet av anestesi genom att testa den bakre reflex.
OBS: Frånvaron av svansreflex är en indikator på tillräcklig anestesi. - Placera en råtta i ryggläge på en operation plattform med en värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen. Raka buken hos råtta med ett djurhår klippare och hår remover lotion för att undvika kirurgiska föroreningar. Skrubba rent rakad buken med Betadine eller annan rengöringsreagens innan operationen.
OBS: Det är viktigt att upprätthålla ett sterilt område under hela förfarandet. - Gör en 2 cm snitt längs mittlinjen av buken med en skalpell. Med hjälp av normal saltlösning, hålla buken organ fuktig under operationen. Förskjuta matsmältningsorganen noga på sidan med bomullstussar för att exponera den nedre hålvenen som ligger i den bakre peritoneal regionen. Identifiera bukaortan, som ligger placerad intill och vanligtvis påkvar av den nedre hålvenen.
OBS! Bukaorta är det fartyg som pulserar i takt med hjärtfrekvensen. - Tränga igenom bukhinnan med en pincett för att avslöja fartygen under. isolera försiktigt bukaortan intill njurartärerna och passera en 8 cm lång 4-0 siden sutur under bukaorta mellan ursprunget till höger och vänster njurartärerna.
- Gör en lös dubbelknut med suturen; lämna en slinga 3 mm diameter och placera avtrubbade och böjda 22 G nål i slingan. Dra åt knuten runt aorta och nålen, och sedan ta bort nålen omedelbart för att uppnå en förträngning 0,7 mm diameter.
- Stäng bukhålan med 6-0 absorber suturmaterial. Sutur muskel eller hudincisionerna med enkla avbrutna suturer. För att förhindra infektion, skrubba operationsområdet med en jod tinktur.
- Observera djuret försiktigt tills det återfår tillräcklig medvetenhet, vilket indikeras av den fria rörlighetenoch födointag. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. För att förhindra post-kirurgi smärta, behandla råtta med acetaminofen (300 mg / kg i 0,5 ml, ip).
OBS: Användare bör administrera analgetika som godkänts av institutionella politik.
2. vävnad och blod Provtagning
- Vid 10 veckor efter operation, väger råtta och söva den med pentobarbital (75 mg / kg i 0,5 ml, ip). Före operation, bekräftar anestesidjupet genom att testa sin svans reflex. Placera råttan på en metallbricka.
- Gör en 2 cm snitt längs mittlinjen av halsen med hjälp av en skalpell. Förskjuta musklerna försiktigt med pincett för att exponera luftstrupen. Observera noga för att identifiera halspulsåder, som är parallella med luftstrupen och pulsera i takt med hjärtfrekvensen.
- Samla upp blod från karotidartären in i en blodinsamlingsröret belagt med EDTA. centrifug omedelbartblodet under 15 min vid 2000 xg och samla plasmat. Lagra blodplasmat vid -80 ° C tills de behövdes.
- Göra en 5 cm snitt vid bröstkorg regionen, runt mittlinjen på xyphoid process. Tränga igenom membranet med skarpa pincett. Med hjälp av en sax, klippa och ta bort bröstkorgen längs mitt klavikulära linjer på båda sidor för att exponera hjärtat. Skära hjärtat försiktigt längs de hjärt- och kärlgränser. Ta hjärtat försiktigt utan att ta tag i vävnaden.
- Montera hjärta på en modifierad Langendorff perfusion apparat genom att binda aorta stammen perfusion nålen. BEGJUTA hjärtat med Krebs buffert (innehållande 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCOa 3, och 11 mM glukos [pH 7,4]) för att tvätta bort blodet. Väg hjärtat och beräkna hjärtvikt-till-kropp-viktförhållande. Fixera hjärtat med 4% paraformaldehyd på isen. Kom ihåg att bära en mask, eftersom paraformaldehyd ånga är toxic.
3. Tissue Fibros Kvantifiering
- Placera paraformaldehyd-fixerade hjärtvävnaden på en vävnad sektionering enhet och skär 2 mm tjocka sektioner. Placera vävnadssnitten i en inbäddning kassett. Dehydratisera vävnaden genom en serie av graderade bad alkohol (50%, 75%, 95%, och 100% under 1 timme vardera).
- Infiltrera vävnaden med xylen under 1 timme och slutligen i vax under 1 timme. Placera infiltrerad vävnaden i en inbäddning kassett och bädda med paraffinvax. Förvara inbäddade vävnader i paraffinblock vid rumstemperatur tills microtoming.
- Skiva den inbäddade vävnaden i 4 | j, m tjocka sektioner. Placera delarna i en 45 ° C vattenbad. Doppa en glasskiva i vattenbadet vid en vinkel och gradvis närma sig paraffin sektions kanter för att tillåta delvis fastsättning på bilden.
- Flytta sliden i och ut ur badet för att avlägsna potentiella luftfickor under avsnittet vävnad och att underlätta bättre infästning. torrt than glider vid 37 ° C under 1 timme och förvara dem i rumstemperatur för histologisk färgning.
- Sätt bilden i en tank. Avparaffinera sliden med xylen i 30 min och rehydrera det i tur och ordning utspädd alkohol (95%, 75% och 50% för 3 min vardera) och slutligen i destillerat vatten. Använda adekvat picrosirius röd lösning för att fullständigt täcka de vävnadssnitt under 1 timme. Skölj glasen i en 0,5% ättiksyralösning för två förändringar, och sedan utföra två sköljningar i absolut alkohol.
- Lufttorka bilden och montera bilden i konstharts med ett täckglas. Fotografera bilden på ett synligt ljusfält.
OBS: Det röda området i fotografiet visar en picrosirius röd positiv zon under ett mikroskop med 200 gångers förstoring. Beräkna hur stor andel av picrosirius röda positiva zonen över hela ytan, vilket indikerar omfattningen av fibros 11.
4. Blod Troponin Kvantifiering
- Kvantifiera plasma troponin nivåeranvändning av en enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). Analysera varje prov. Belastning 50 pl blodplasma och 50 | il av en antikropp cocktail i lämpliga brunnar. Förslut plattan och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur på en plattskakanordning vid 400 rpm.
OBS: Cardiac troponin i plasma är en markör för hjärtskada. - Aspirera vätska och tvätta varje brunn med 250 pl tvättbuffert tre gånger. Efter den sista tvättningen, vänd plattan och blot den mot rena pappershanddukar för att avlägsna överdriven vätska.
- Tillsätt 100 pl av tetrametylbensidin-substrat till varje brunn och inkubera under 10 minuter i mörker på en plattskakanordning vid 400 rpm. Tillsätt 100 pl stopplösning till varje brunn. Skaka plattan på en plattskakanordning under 1 min för att blanda. Registrera den optiska densiteten (OD) vid 450 nm.
OBS! Troponin koncentrationen är proportionell mot OD-värdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 veckor efter den abdominala aorta sammandragning kirurgi, omrördes den resulterande hjärtpatologi analyseras. Hjärt histologi mättes genom att beräkna förhållandet mellan hjärtvikt till kroppsvikt och genom att detektera mängden kollagen i hjärtat. Hjärtskada bekräftades genom att mäta plasma cardiac troponin koncentration.
Såsom visas i figur 1 A, var hjärtstorlek förstoras efter abdominal aortic sammandragning operation, vilket framgår av en högre hjärtvikt-till-kropp-viktförhållande (Figur 1B), en indikator på hjärthypertrofi. Genom att använda picrosirius rödfärgning, kan fibrotisk myokardium färgas med en ökad halt av kollagen (röd) särskiljas från normala områden (gul, Figur 2). Hjärtfibros ökades efter abdominal aortic sammandragning kirurgi (Figur 2B) jämfört med c ONTROLLER (Figur 2A). Resultaten korrelerar med plasma troponin koncentrationer (Figur 3). En ökad troponin koncentration tyder på att hjärt ombyggnad och skada under övertryck har inträffat. Sammantaget abdominal aortic förträngningsresulterar i tydlig hjärtskada, märkt hjärthypertrofi och vävnadsombildning.
Figur 1:. Hjärthypertrofi under övertryck (A) representant hjärta och (B) hjärt vikt-kroppsvikt förhållanden visas 10 veckor efter abdominal aortic sammandragning kirurgi. Data representerar medelvärdet ± SEM för sex oberoende experiment som utförs. Skillnader mellan grupper utvärderades genom Students t-test. * P <0,05 i förhållande till kontroll. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: hjärtfibros under övertryck.
Picrosirius röd färgning avslöjade ökad kollagenuttryck. (A) representant picrosirius rödfärgning (Skalstreck = 200 nm) och (B) procent av fibrotisk område 10 veckor efter abdominal aortic sammandragning kirurgi. Data representerar medelvärdet ± SEM för sex oberoende experiment som utförs. Skillnader mellan grupper utvärderades genom Students t-test. * p <0,05 jämfört med kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
s / ftp_upload / 54818 / 54818fig3.jpg "/>
Figur 3: hjärtskada under övertryck.
blodplasma troponin koncentrationer mättes 10 veckor efter abdominal aortic sammandragning kirurgi. Data representerar medelvärdet ± SEM för sex oberoende experiment som utförs. Skillnader mellan grupper utvärderades genom Students t-test. * p <0,05 jämfört med kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
- Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 111, 131-150 (2012).
- Towbin, J. A.
- Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Dis Model Mech. 3, 138-143 (2010).
- van Bilsen, M., van Nieuwenhoven, F. A., van der Vusse, G. J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimental? Cardiovasc Res. 81, 420-428 (2009).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Gu, W. L., Chen, C. X., Huang, X. Y., Gao, J. P. The effect of angoroside C on pressure overload-induced ventricular remodeling in rats. Phytomedicine. 22, 705-712 (2015).
- Zhang, Y., et al. Alteration of cardiac ACE2/Mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol. 57, 335-342 (2014).
- Tardif, K., et al. Nestin upregulation characterizes vascular remodeling secondary to hypertension in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1265-H1274 (2015).
- Li, C., et al. Myeloid mineralocorticoid receptor deficiency inhibits aortic constriction-induced cardiac hypertrophy in mice. PLoS One. 9, e110950 (2014).
- Ku, H. C., Su, M. J. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PLoS One. 9, e85634 (2014).
- Lee, S. Y., et al. Caffeic acid ethanolamide prevents cardiac dysfunction through sirtuin dependent cardiac bioenergetics preservation. J Biomed Sci. 22, 80 (2015).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. J Vis Exp. , e50983 (2014).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Schaefer, A., et al. A New Animal Model for Investigation of Mechanical Unloading in Hypertrophic and Failing Hearts: Combination of Transverse Aortic Constriction and Heterotopic Heart Transplantation. PLoS One. 11, e0148259 (2016).
- Rodriguez-Iturbe, B., Quiroz, Y., Kim, C. H., Vaziri, N. D. Hypertension induced by aortic coarctation above the renal arteries is associated with immune cell infiltration of the kidneys. Am J Hypertens. 18, 1449-1456 (2005).
- Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of Caffeic Acid with Pyrrolidine Enhances Antioxidant Ability by Activating AKT/HO-1 Pathway in Heart. PLoS One. 11, e0148545 (2016).
- Bovill, J. G. Intravenous anesthesia for the patient with left ventricular dysfunction. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 10, 43-48 (2006).
- Inoko, M., Kihara, Y., Morii, I., Fujiwara, H., Sasayama, S. Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats. Am J Physiol. 267, H2471-H2482 (1994).
- Heyen, J. R., et al. Structural, functional, and molecular characterization of the SHHF model of heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1775-H1784 (2002).
