Introduction
Epilepsi er en almindelig neurologisk lidelse, hvor tilbagevendende anfald forekomme i hele patientens levetid. De fleste epileptiske gentagelser kan godt kontrolleret af antiepileptika (AED'er). Men omkring 30% af epileptiske patienter udvikler refraktær epilepsi 1. Epilepsi årsager søvn forstyrrelser, hvilket yderligere kan forværre gentagelse. Beviser viser, at epilepsi enten kan forstyrre søvn om natten eller kan forårsage overdreven søvnighed i dagtimerne 2,3. Vores tidligere undersøgelser indikerer yderligere, at epilepsi forekommer ved zeitgeber tid (ZT) 0, dvs i begyndelsen af det lys periode i lyset: mørke cyklus, falder søvn; Dette medieres af corticotropin-frigørende hormon (CRH), en homøostatisk faktor. Epilepsi på ZT13 (begyndelsen af den mørke periode) øger ekspressionen af en anden homeostatiske faktor, interleukin-1 (IL-1), hvilket øger søvn. Sleep døgnrytmer er ændret, når epilepsi forekommer ved ZT6, midt pålysperiode 4,5. På den anden side, søvnproblemer yderligere forværre progression og gentagelse af epilepsi 6. Baseret på ovennævnte beviser, prøver vi at afsløre en optimal terapeutisk metode til samtidig at styre epilepsi og forhindre søvn forstyrrelser i epilepsipatienter. Vi har tidligere vist sig, at elektroakupunktur (EA) med en 10-Hz stimulation frekvens, ved hvilken en bestemt mængde strøm afgives til acupoint gennem en nål af rustfrit stål, med succes undertrykker electrocorticogram (ECoG) epileptiske aktiviteter og epilepsi induceret søvnforstyrrelser 7 . EA med en 100-Hz stimulation frekvens forværres yderligere epileptiske aktiviteter og søvn forstyrrelser i rotter 8,9. Denne vellykkede eksperiment afhænger af tre faktorer: For det første en gennemførlig epileptisk dyremodel; dels en fremgangsmåde til søvn registrering og analyse hos gnavere; og for det tredje, den præcise udførelse af akupunktur og nøjagtigheden af acupoint locations.
Epilepsi er blevet kategoriseret i to hovedtyper: fokal epilepsi og generaliseret epilepsi. Vi er interesseret i omdrejningspunkt FLE (TLE), generaliseret epilepsi, status epilepticus (SE), og en gentagelse af spontan generaliseret epilepsi. Derfor er forskellige manipulationer anvendes til at skabe egnede epileptiske modeller for vores eksperimenter. At etablere focal TLE, er en lav dosis af pilocarpin administreret i venstre centrale kerne af amygdala (CEA). For at verificere denne model, er seks ECoG elektroder implanteret på den frontale (F1 & F2), parietal (P1 & P2), og occipital (O1 & O2) lapper i både venstre og højre hjernehalvdel, og yderligere to reference elektroder (R1 & R2) er placeret over cerebellum i begge halvkugler. En yderligere mikroinjektion guide kanyle implanteres kirurgisk i den venstre CEA (AP, 2,8 mm fra bregma; ML, 4.2 mm; DV, 7,8 mm i forhold til bregma). Koordinaterne er tilpasset fra Paxinos og Watson rotte atlas 10. Hvis omdrejningspunktet TLE succes induceres, kun optagelsen fra elektrode på venstre parietal cortex (P1), som er nær venstre CEA, bør erhverve de dominerende epilepsilignende ECoGs, med ingen væsentlige epilepsilignende ECoGs optaget fra de andre ECoG elektroder. Intraperitoneal (IP) injektioner af pilocarpin i rotter fremkalder generaliserede epilepsi og SE, men det kan være fatalt. Fem IP injektioner af pentylentetrazol (PTZ) med en en-dages interval mellem hver injektion held fremkalde spontan generaliseret epilepsi hos mus og også sikre musenes overlevelse. To wire ECoG elektroder implanteres i frontal og parietal cortex i musene at modtage ECoG signaler og kontrollere spontant tilbagevendende epilepsi.
Polysomnografi (PSG) er en omfattende fremgangsmåde til at registrere fysiologiske ændringer, som opstår under søvn, og det kan objektivt klassificere søvn i forskellige stadier af ikke-hurtige øjenbevægelser (NREM) og rAPID øjenbevægelser (REM) søvn. PSG registrerer parametre af kropsfunktioner, herunder hjernebølger (Elektroencefalogram, EEG), øjenbevægelser (electrooculogram, EOG), skeletmuskel toner (elektromyogram, EMG), hjerterytme (elektrokardiogram, EKG), og blod ilt niveauer og respiratoriske parametre. Hos rotter, registrerer vi ECoGs, EMGS, kortikal temperatur og motorisk aktivitet at klassificere årvågenhed stater i vågenhed, NREM søvn, og REM-søvn. Søvnanalyse i mus udføres under anvendelse ECoGs, EMGS og bevægelsesaktivitet resultater. Rotter kirurgisk implanteret med tre ECoG skrue elektroder på frontal, parietal og kontralaterale cerebellare cortex ved stereotaktisk kirurgi. Post-erhvervelse bestemmelse af årvågenhed tilstande (vågenhed, NREM søvn, og REM søvn) er udført i overensstemmelse med de parametre, der er erhvervet fra ECoGs, EMG, hjerne temperatur og motorisk aktivitet. Detaljerede kriterier for kategorisering dyrets adfærd hos både rotter og mus er beskrevet i than protokol.
Både rotter og mus skal bedøves med en lav dosis af zoletil (25 mg / kg), hvilket er halvdelen af den dosis af anæstetika indgives normalt under stereotaktisk kirurgi, før der udføres manuel akupunktur eller EA. Denne dosering tillader dyr at vågne op 30 til 35 min efter injektionen. Enten manuel akupunktur eller EA udføres ved begyndelsen af den mørke periode, med et konstant tidsrum på 30 minutter, og hvert dyr konsekutivt behandlet i to til tre dage. Stimulerende EA strømme leveres ind i en bestemt acupoint gennem en nål af rustfrit stål, der er indsat i acupoint. Stimulus nuværende er et tog af tofasede firkantede impulser, hvor impulsvarigheden er 150 ms og stimulering intensitet er 1 mA. Hvis der anvendes en tør nål til manuel akupunktur nålen indsættes i akupunkter spjættede 10 gange hver 5 min. Den sværeste del af manuel akupunktur eller EA er at lokalisere de akupunkter i gnavere. LOCation af akupunkter i rotter eller mus ligner deres anatomiske placering i mennesker. For eksempel er de bilaterale Fengchi akupunkter placeret 3 mm væk fra den bageste midterlinie på halsen, mellem de to ører, hvilket svarer til dens anatomiske placering i mennesker 11. Endvidere kan akupunkter med lav impedans på huden blive yderligere bekræftet. Sham akupunktur eller fingeret EA manipulation er nødvendig for akupunktur eller EA eksperimenter. Sham akupunktur eller sham EA bør udføres ved en ikke-acupoint placeret tæt på acupoint, såsom nær armhulen 12.
For med held at undersøge virkningerne af akupunktur eller EA om epilepsi og epilepsi-induceret søvn forstyrrelser, skal følgende faktorer være på plads: en mulig epileptisk dyremodel, den præcise analyse af epilepsilignende ECoGs og fornyet epilepsi, en metode til at klassificere årvågenhed stater og nøjagtig ydeevne af akupunktur eller EA i gnavere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprotokoller er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) for National Taiwan University.
1. stereotaktisk kirurgi til implantering ECoG Elektroder, EMG elektroder, Brain Thermistor, og Injection Guide Kanyle
- For rotter (250 - 350 gi, 6- til 8-uger gamle Sprague-Dawley-rotter)
- Bedøver rotterne ved IP injektion med 50 mg / kg zoletil. Bekræft den korrekte dybde af anæstesi ved at observere en manglende respons efter klemning bagpoten. Anvend øjensalve, barbere pelsen, og sterilisere huden med povidon-jodopløsning og 75% ethanol. Injicere et antibiotikum (penicillin G) for at forhindre infektion.
- Forbered skalpeller, sakse, hemostats, gaze og cautery maskine til kirurgi. Sterilisere kirurgiske redskaber og gazer af en autoklave og cautery med 75% ethanol.
- Placer en øre bar ind i øregangen og monter rotten til stereotaxis.
- Ved brug afen skalpel, gør en omtrentlig 2-cm midtlinieincision på skallen langs en linje mellem to ørerne, bevæger sig kaudalt. Klippe hudlapper med hemostats at eksponere kraniet og fjerne væv i kraniet ved en skalpel.
- Bor otte huller (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1 og R2), hver ca. 0,7 mm i diameter, på kraniet med en roterende værktøj. Skru otte ECoG elektroder på de forreste, parietal og occipital lapper og lillehjernen i både venstre og højre hjernehalvdel. Disse elektroder anvendes til fokal epilepsi detektion.
- Brug følgende koordinater for optagelsen elektroder: frontal (F1 og F2): 2,0 mm anterior til bregma og 2,5 mm fra midterlinjen, parietal (P1 og P2): -2,0 mm anterior til bregma og 3,0 mm fra midterlinjen og occipital (O1 og O2): -5.5 mm anterior til bregma og 3,0 mm fra midterlinien.
- Placer to referenceelektroder (R1 og R2) i løbet af lillehjernen (-11,0 mm anterior til bregma og 4,0 mm fra midline).
- I et separate grupper af rotter, bore tre huller og placere to skrue EEG elektroder over højre frontale (F2) og parietale lapper (P2) af cortex med de samme koordinater som beskrevet i trin 1.1.5.1. Placer en tredje EEG elektrode over venstre lillehjernen (R1), som tjener til at jorde dyret og reducere signal artefakter. Disse elektroder anvendes til at bekræfte generaliseret epilepsi og analysere overvågningsindberetninger stadier.
- Adskil hals hud og muskler og indsæt to EMG elektroder ind i halsen muskel.
- Bor et andet hul på kraniet og placere en mikroinjektion guide kanyle i den venstre CEA (AP, 2,8 mm fra bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 mm i forhold til bregma) hos rotter. Koordinaterne er tilpasset fra Paxinos og Watson rotte atlas 10.
- Bore et større hul (med en diameter på 1,6 mm) på kraniet og indsætte et kalibreret 30-kV termistor på overfladen af den parietale cortex, som vil blive cementeret senere, at monitor det kortikale temperatur i rotter.
- Brug gaze og kautering at standse blødninger, når den opstår.
- Før isolerede ledninger fra ECoG elektroder og EMG elektroder til en piedestal og tilslut termistor til linen. Cement piedestalen og guide kanyle til kraniet med dental akryl.
- Behandl snittet topisk med polysporin (zinkbacitracin / polymyxin B sulfat) for at forhindre infektion. Giv dyrene både ibuprofen og penicillin G i vand i en uge efter operationen.
- For mus (20 - 30 g, 6- til 8-uger gamle C57BL / C mus)
- Bedøver musene ved IP-injektion med 50 mg / kg zoletil og bekræfte korrekte dybde af anæstesi ved at observere en manglende respons efter klemning bagpoten. Anvend øjensalve. Efter barbering, sterilisere huden med povidon-iod-opløsning og 75% ethanol. Injicere et antibiotikum (penicillin G) for at forhindre infektion.
- Placer en øre bar ind i øregangen ogmontere musen til stereotaxis.
- Ved hjælp af en skalpel, lave en omtrentlig 1,5 cm midtlinieincision på skallen langs en linje mellem de to ører, bevæger kaudalt. Klippe hudlapper med hemostats at eksponere kraniet og fjerne væv over kraniet med en skalpel.
- Poke to huller på kraniet med kirurgiske sakse og placere to wire ECoG elektroder på højre pandelap (F2: +2,0 mm til bregma og 1,5 med midterlinjen) og venstre parietal lobe (P1: -3.0 mm til bregma og -2,5 mm med midterlinjen).
- Adskil hals hud og muskler og indsæt to EMG elektroder ind i halsen muskel.
- Forbind isolerede ledninger fra wire ECoG elektroder og EMG-elektroder til de kvindelige terminaler og en 2,54 mm stik, og derefter cement til kraniet med dental akryl.
- Behandl snittet topisk med polysporin (zinkbacitracin / polymyxin B sulfat) for at forhindre infektion. Giv dyrene både ibuprofen og penicillin G i vand for en week efter operationen.
- Tillad alle dyr til at inddrive i syv dage forud for indledningen af forsøgene.
- House rotter eller mus separat i individuel registrering bure, i den isolerede rum, hvor temperaturen holdes på 23 ± 1 ° C, og lys: mørke (L: D) rytme styres i et 12: 12-h-cyklus (40 W x 4 rør belysning). Give mad og vand ad libitum.
- Tilslut ECoG, EMG, og termistor gennem en tøjr til forstærkerne en uge efter operationen for at starte optagelserne.
2. Etablering af Focal TLE Epilepsi, SE, og spontant Tilbagevendende Epilepsi
- for rotter
- Administrere 0,5 pi af pilocarpin (2,4 mg / pl) i den venstre CEA ved injektion guide kanyle ved anvendelse af en mikroinjektion pumpe. Injektionen sats bør fastsættes til 0,2 uL / min for at fremkalde fokale TLE.
- IP injicere 300 mg / kg pilocarpin at inducere generaliseret epilepsy med tilbagevendende SE.
- for mus
- IP administrere PTZ (0,035 mg / g mus legemsvægt) på et bestemt ZT punkt hver anden dag. Fem på hinanden følgende injektioner vil forårsage udviklingen af spontant og gentagne generaliseret epilepsi.
- For både rotter og mus
- Forstærk de ECoG signaler ved 5000 og filtrere de analoge bandpass mellem 0,1 og 40 Hz.
- Brug en A / D konvertering bord til at konvertere de analoge ECoGs signaler til digitale signaler med en 128-Hz sampling rate.
- Brug en software til visuel scoring og analysere indtræden og varighed af epilepsi. Måle den tid målestok for at repræsentere varigheden.
- Definer ECoG epilepsi ved fremkomsten af epileptiske pigge med amplituder større end 2 mV og med varigheder på mere end 30 s 13.
3. Klassificering af Årvågenhed stater
- for rotter
- Bestem årvågenhed stater ved hjælp af parametrene erhvervet fra ECoGs, EMG, hjerne temperaturer og bevægelse inden for en 12-s episode af optagelsen. Tilslut ECoG, EMG, og termistor gennem en tøjr til forstærkerne en uge efter operationen for at starte optagelsen. Score staterne med en skræddersyet software ifølge trin 3.1.5 - 3.1.7.
- Mål lokomotoriske aktiviteter, der benytter en infrarød bevægelsesdetektor, integrere de signaler hver 1 s, og gemme signaler.
- Mål kortikal temperatur og gemme signaler.
- Klassificere årvågenhed stater i henhold til vores tidligere definerede kriterier 14.
- Score vågenhed ved hjælp af følgende karakteristika: lille amplitude ECoGs med højfrekvente spektre, højere delta power (0,5 - 4,0 Hz), og lavere theta strøm (6,0 - 9,0 Hz); dominerende bevægelsesaktivitet; høj EMG aktivitet; og gradvis stigende kortikal temperatur.
- Score NREM søvn ved hjælp af following egenskaber: delta-bølge dominerende ECoGs med store amplituder, faldt EMG-aktivitet, reduceret cortical temperatur, og ingen lokomotorisk aktivitet.
- Score REM søvn ved hjælp af følgende egenskaber: nedsat amplitude ECoGs med den dominerende theta frekvens, pludselig øget kortikal temperatur, minimal EMG aktivitet og lav bevægelsesaktivitet med kroppens ryk.
- for mus
- Gentag klassificeringen af årvågenhed stater i mus som gennemført i rotterne, medmindre der er ingen kortikale temperatur optaget fra termistor.
4. Udførelse af manuel akupunktur og EA i rotter
- Rotten bedøves for EA-protokollen.
- Find acupoint af anatomi og bekræft lav hud impedans på acupoint. Den blinker, når detektere lave hud impedans. Bemærk: Fengchi akupunkter er placeret 3 mm væk fra den bageste midterlinie værelem de to ører, på halsen.
- Indsæt rustfrit stål nåle ind akupunkter i en dybde på 2 mm.
- Twitch de indsatte nåle 10 gange hver 5 min.
- Ved hjælp af en funktionel elektrisk stimulator, levere et tog af tofasede pulser (150-mikrosekunder varighed hver) med en intensitet på 1 mA til akupunkter gennem nålen.
- Udfør en fingeret akupunktur eller sham EA som kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er forskellige rotte- og musemodeller at tilfredsstille behovene hos forskellige epilepsi typer. For at inducere fokal TLE, 0,5 pi af pilocarpin (2,4 mg / pl) indgives i den venstre CEA. De dominerende epilepsilignende ECoGs erhverves fra ECoG elektrode på parietal lap af venstre hjernehalvdel (figur 1A: b), og sjældne epileptiske aktiviteter samles op fra resten af ECoG elektroder (figur 1A: a, c, d, e og f), når pilocarpin administreres. Epilepsilignende ECoGs primært optaget umiddelbart efter pilocarpin administration. Disse resultater er adopteret fra 8. Disse resultater indikerer den vellykkede induktion af fokal TLE i rotter efter direkte injektion af lav-dosis pilocarpin i CEA.
Inden 5 min, IP ifremskrivningen på 300 mg / kg pilocarpin inducerer alvorlige kolinerge effekter på adfærd, såsom hårrejsning, savlen, røde øjne, kulderystelser, og ansigts automatik. Sværhedsgraden af disse adfærdsmæssige tegn øges gradvist, indtil en ECoG generaliseret anfald forekommer (figur 1B, blå boks). SE forekommer også efter den generaliseret epilepsi (figur 1B, rød boks). Disse resultater er adopteret fra 13. Vores resultater antyder, at en IP-injektion af 300 mg / kg pilocarpin er en pålidelig metode til at inducere ECoG-dokumenteret generaliseret epilepsi og SE. Men overlevelsesraten efter SE udvikling er mellem 15% og 20%. PTZ-kindling model for epilepsi i mus anvendes til at udvikle spontant og gentagne generaliseret epilepsi. PTZ i en dosis på 0,035 mg / g mus legemsvægt er IP indsprøjtes ved en særlig ZT punkt (f.eks begyndelsen af den mørke periode, ZT13) er hver anden dag, og hver injektion adskilt af en en-dages interval. Der er ingen epileptiformeECoGs fundet under den mørke periode efter 1. injektion af PTZ (figur 1C: a) eller under den efterfølgende mørke periode, når det er en off dag til injektion (figur 1C: b). Ingen signifikant epileptisk aktivitet er fundet efter 2., 3., og 4. injektioner (data ikke vist her). Imidlertid er epilepsilignende ECoGs induceres efter 5 th PTZ injektion (figur 1C: c og d), sammen med spontant og gentagne generaliseret epilepsi (Figur 1C: e og a ').
Vi klassificeret årvågenhed stater i vågenhed, NREM søvn, og REM-søvn i henhold til de kriterier, vi er nævnt i protokollen. Vågenhed visuelt scoret af desynkroniseres ECoGs med lav amplitude og høj frekvens. Effekttæthed værdier i delta-båndet (0,5 - 4 Hz) er generelt større end dem itheta frekvensbåndet (6 - 9 Hz) under vågenhed, og mere højfrekvent spektre (> 10 Hz) findes. Vågenhed udviser en høj amplitude på EMG og masser af bevægelsesaktivitet. Desuden kortikal temperaturen gradvist øges, når de årvågenhed statslige transitter fra enten NREM søvn eller REM-søvn til vågenhed (Figur 2). NREM søvn er karakteriseret ved synkroniserede ECoGs med høj amplitude og lav frekvens. Værdierne effekttæthed er dominerende i deltaet frekvensbåndet. Den EMG amplitude gradvist falder, og ingen motorisk aktivitet er udstillet under NREM søvn. Kortikal temperaturen falder, når årvågenhed statslige transitter fra vågenhed i NREM søvn (Figur 2). Under REM-søvn bliver ECoG bølge desynkroniseret, amplituden er reduceret, den dominerende EEG effekttæthed forekommer i theta frekvens (6,0 - 9,0 Hz), EMG-aktivitet er den laveste, fasisk organ spjæt observeres, og kortikal temperatur hurtigt stiger(Figur 2).
Vi demonstrerede de forskellige virkninger af EA på epileptisk aktivitet, når EA stimulerer Fengchi akupunkter med enten en højfrekvent stimulering (100 Hz) eller en lavfrekvent stimulation (10 Hz). I figur 3A, et mikroinjektion af 0,5 pi af pilocarpin (2,4 mg / pl) i den venstre CEA inducerer fokal TLE, som tidligere (B) nævnt. Men 100-Hz EA bilaterale Fengchi akupunkter forværrer pilocarpin-induceret epilepsilignende ECoGs (C). Disse resultater er tilpasset fra 8. I modsætning hertil 10 Hz EA bilaterale Fengchi undertrykker pilocarpin-induceret epilepsilignende ECoGs (Figur 3B: C). Disse resultater er tilpasset fra 7. Administration af pilocarpin i venstre CEA undertrykker også NREM søvn under lyset periode af 12 timers lys: mørke cyklus (figur 4A & 4B). Reduktionen af NREM søvn under AFew timer af den mørke periode skyldes primært virkningen af anæstesi, og er ikke en direkte effekt af EA 15. Anvendelsen af 100-Hz EA forværres yderligere af pilocarpin-inducerede suppression af NREM søvn (figur 4A). I modsætning hertil 10 Hz EA bilaterale Fengchi akupunkter øger NREM søvn per se i den mørke periode og blokerer pilocarpin-induceret reduktion af NREM søvn i løbet af lys periode (figur 4B). Disse resultater er adopteret fra 9.
Figur 1: Forskellige Epilepsi Modeller i rotter og mus. A viser omdrejningspunktet TLE i rotter. B belyser generaliseret epilepsi med SE i rotter. C angiver de spontane og tilbagevendende epilepsilignende ECoGs. (A) (a), (b), (c), (d), (e) og (f) at repræsentere ECOG signaler optaget fra elektroder placeret på den venstre frontale, venstre parietale, venstre nakke, højre frontal, højre parietale, og højre nakke cortex henholdsvis. (B) Pilen angiver IP injektion af pilocarpin. Den grå boks (a) viser de grundlæggende ECoGs opnået inden pilocarpininjektion. Den blå boks viser epilepsilignende ECoGs af generaliseret epilepsi. Den røde kasse (b) repræsenterer SE. De ECoG signaler ekstraheret fra (a) og (b) er vist i (a ') og (b'). (C) (a) repræsenterer ECoGs erhvervet efter den 1. PTZ injektion og (b) repræsenterer ECoGs registreret dagen efter 1. PTZ injektion i mus. Epileptiske aktiviteter foregår efter 5 th PTZ injektion (c) og bagefter. De tilbagevendende epileptiske ECoGs der opstår dagen efter 5 th PTZ injektion er vist i (d). De tilbagevendende epileptiske ECoGs optaget 5 dage efter 5 th PTZ injektion er vist i (e) . Tallet i bunden (a) repræsenterer ECoGs udvundet fra den røde boks. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Klassifikation af Årvågenhed stater: Vågenhed, NREM Sleep, og REM-søvn. Årvågenhed tilstande af rotter er klassificeret af parametrene fra ECoGs, ECoG spektre, EMGS, motorisk aktivitet, og kortikal temperatur. Årvågenhed stater i mus er kendetegnet ved de samme parametre, undtagen cortical temperatur er ikke relevant.
Klik her for at se en større version af dette tal.
pload / 54896 / 54896fig3.jpg "/>
Figur 3: Virkningerne af 100-Hz og 10-Hz EA på Epilepsi. I (A), den første ECoG spor påviser baseline ECoGs (a). Mikroinjektion af pilocarpin i den venstre CEA inducerer fokal TLE (b). Anvendelse af 100-Hz EA ved bilaterale Fengchi akupunkter forværrer epilepsilignende ECoGs (c). I (B), den første ECoG spor påviser baseline ECoGs (a). Den mikroinjektion af pilocarpin i den venstre CEA inducerer fokal TLE (b). Anvendelsen af 10-Hz EA ved bilaterale Fengchi akupunkter undertrykker epilepsilignende ECoGs (c). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Virkningerne af 100-Hz og 10 Hz EA på Epilepsy-induceret Sleep afbrydelser. (A) Focal TLE induceret ved mikroinjektion af pilocarpin i den venstre CEA reducerer NREM søvn under lysperioden. 100-Hz EA forværres yderligere af epilepsi-inducerede søvnforstyrrelser. (B) Anvendelsen af 10-Hz EA blokerer epilepsi-induceret reduktion af NREM søvn i løbet af lys periode. Endvidere 10-Hz EA forbedrer NREM søvn under den mørke periode. Værdier er repræsenteret som middelværdi ± SEM. Den sorte cirkel repræsenterer værdierne opnået før mikroinjektion af pilocarpin, den åbne cirkel afbilder data indhentet efter pilocarpininjektion, og den åbne trekant viser værdierne opnået efter EA stimuli. Den sorte søjle repræsenterer den mørke periode af 12 timers lys: mørke cyklus, og den hvide bjælke viser lys periode. * Repræsenterer statistisk forskel mellem 100-Hz EA + pilocarpin og kontrolgruppen (ANOVA, p <0,05) og # indikerer den statistiske difference mellem den 10-Hz EA + pilocarpin gruppen og pilocarpin gruppen (ANOVA, p <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
At vælge en gennemførlig epilepsi dyremodel er afgørende for hver forsøgsgruppe formål. Et af vores mål er at belyse effekten af EA på epilepsi undertrykkelse. EA er en alternativ medicin, som kan udvise terapeutisk virkning i epilepsi og er dokumenteret i gamle kinesiske litteratur. Men der er en mangel på videnskabelige beviser til at bevise det. For at bestemme virkningerne af EA på epilepsi, vi primært fokuseret på virkningerne af EA på mild fokal epilepsi, snarere end på svær generaliseret beslaglæggelse eller SE. Vores tidligere undersøgelse anvendte et samlingspunkt TLE model i rotter for at demonstrere effekten af lavfrekvent (10 Hz) og høj-frekvens (100 Hz), EA bilaterale Fengchi akupunkter på pilocarpin-induceret fokale TLE og fokale TLE-induceret søvn forstyrrelser 7- 9. Vores resultater tyder på, at 10-Hz EA bilaterale Fengchi akupunkter undertrykker omdrejningspunkt TLE og søvn forstyrrelser, mens 100-Hz EA forværrer både omdrejningspunkt TLE og TLE-inducerede søvnforstyrrelser. Et andet eksempel er to demonstrere effekten af dyb brain stimulation på refraktær epilepsi, især generaliseret beslaglæggelse og SE. Vi bestemt, at ensidig deep brain stimulation af den forreste kerne af thalamus (ANT) med højfrekvente og lavintensive strømninger succes hæmmer en gentagelse af generaliseret epilepsi og varigheden af SE 13. Vi udviklede også spontant og gentagne generaliseret epilepsi ved hjælp af PTZ-pindebrænde metode i mus. Denne PTZ-pindebrænde model kan i vid udstrækning anvendes til epilepsi studier. Det kritiske skridt for oprettelse af disse epilepsi modeller er brugen af de relevante doser. En mikroinjektion af større mængder af pilocarpin til CEA kan udvikle sekundær generaliseret epilepsi. IP administration af mere end 300 mg / kg pilocarpin inducerer generaliseret epilepsi og SE; imidlertid havde de fleste rotter ikke overleve efter SE udviklet. Desuden doser lavere end 280 mg / kg kunne ikke held etablere generaliseret epilepsi og SE. Denne samme situation sker med PTZ-pindebrænde model. Større doser af PTZ kan forårsage SE, men mange mus overlever ikke. I modsætning hertil lave doser af PTZ kræver flere injektioner til at etablere spontant tilbagevendende epilepsi.
Klassificeringen af forskellige årvågenhed stater i rotter og mus er primært baseret på funktioner i polysomnografi optaget fra mennesker. Vi ændrede protokollen for at analysere søvn-vågne aktivitet ved de værdier, der er optaget fra ECoG, spektral fordeling, EMG, motorisk aktivitet, og kortikal temperatur. De registrerede fra vågenhed og NREM søvn karakteristika ECoG, spektral fordeling, EMG, lokomotorisk aktivitet, og corticale temperatur svarer til dem, der erhverves fra mennesker. Men REM søvn er undertiden tvetydige og vanskelige at klassificere i gnavere. De fleste litteratur beskriver REM-søvn hos gnavere i henhold til dens ECoGs og EMGS. Den theta frekvensbånd ECoGs er fremherskende, og muskeltonus af EMG er lavest, når rotter eller mus enre i REM-søvn. For at øge tilliden til scoring REM-søvn, vi yderligere indspillet bevægelsesaktivitet og kortikal temperatur. Fasisk organ spjæt observeres og kortikal temperatur stiger hurtigt, når rotter indtaster REM søvn. Lokomotorisk aktivitet og kortikal temperatur, ud over de ECoGs, spektrale fordeling og EMGS, forbedre nøjagtigheden for REM-søvn analyse. Jo flere parametre, der er inkluderet, kan de mere præcise klassificeringer gøres.
har altid været kritiseret to vigtigste punkter, når forskere udføre manuel akupunktur eller EA eksperimenter. Det første spørgsmål er, hvordan forskerne identificere og bekræfte akupunkter i rotter. Meridian systemet og akupunkter hos mennesker er veletablerede, men der er ingen meridian systemet og acupoint kort bekræftet hos gnavere. Derfor er lokaliseringen af tilsvarende akupunkter hos gnavere bestemt ifølge den relative anatomiske placering. F.eks Fengchi akupunkter (GB 20) erplaceret i fordybningen mellem den øvre del af musculus sternocleidomastoideus og musculus trapezius hos mennesker. Vi fandt det beslægtede anatomiske placering i gnavere og yderligere bekræftet det ved måling lav hudimpedans. Impedansen af en acupoint er lavere end den omgivende hud. Det andet spørgsmål er, hvordan akupunktur doser styres under eksperimentet. Hvis der anvendes manuel akupunktur til eksperimentet bør manipulation af trækninger nål udføres af samme forsker på samme måde for hver manipulation. Det ville være lettere at styre akupunktur dosis, hvis EA finder anvendelse, da EA sikrer en ensartet stimulering frekvens og strømstyrke. Desuden i analgesi, EA udstiller mere effektivitet end manuel akupunktur 16. Manuel akupunktur og EA med lavfrekvente og højfrekvente stimulation på samme acupoint kan dog aktivere forskellige hjerneområder 17, hvilket kan indebære forskellige ligger til grunding mekanismer.
Sammenfattende dette papir viser flere kemiske-induceret epileptiske modeller i rotter og mus, herunder omdrejningspunkt TLE, generaliseret epilepsi, SE, og spontant og gentagne generaliseret epilepsi. Vi etablerede også det traditionelle og hurtig elektrisk-pindebrænde epileptiske model i rotter. Hvis læsere er interesseret i den elektriske-pindebrænde model henvises til Referencer 4 og 5. Vi tilbyder også kriterierne for at analysere søvn-vågne aktivitet i rotter og mus. For at evaluere effekten af EA på epileptisk aktivitet og søvn, vi beskriver, hvordan at lokalisere de tilknyttede akupunkter i rotter og hvordan man udfører akupunktur, og vi også præsentere nogle repræsentative resultater at demonstrere effekterne af EA på epilepsi og epilepsi induceret søvn forstyrrelser .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X.
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W.
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , Academic Press. San Diego. (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at 'Anmian' (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), Pt 2 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
