Introduction
Epilepsi är en vanlig neurologisk sjukdom där återkommande anfall inträffar under en patients livslängd. De flesta epileptiska återfall kan väl kontrollerad av antiepileptika (AED). Men cirka 30% av epileptiska patienter utvecklar refraktär epilepsi en. Epilepsi orsakar sömnstörningar, vilket ytterligare kan förvärra återfall. Bevis för att epilepsi antingen kan störa sömnen på natten eller kan orsaka överdriven sömnighet under dagen 2,3. Våra tidigare studier visar vidare att epilepsi inträffar vid zeitgeber tid (ZT) 0, dvs början av den ljusa perioden i ljuset: mörker-cykel, minskar sömn; detta medieras av kortikotropinfrisättande hormon (CRH), en homeostatisk faktor. Epilepsi vid ZT13 (början av den mörka perioden) förstärker uttrycket av en annan homeostatisk faktor, interleukin-1 (IL-1), vilket ökar sömn. Sömndygnsrytmen ändras när epilepsi inträffar vid ZT6, i mitten avljusa perioden 4,5. Å andra sidan, sömnproblem förvärra ytterligare progression och återfall av epilepsi 6. Baserat på ovanstående bevis, vi försöker avslöja en optimal terapeutisk metod för att samtidigt styra epilepsi och förebygga sömnstörningar hos epilepsipatienter. Vi fann tidigare att elektroakupunktur (EA) med en 10-Hz stimulering frekvens, i vilken en viss mängd ström levereras till acupoint genom ett rostfritt stål nål, framgångsrikt undertrycker electrocorticogram (ECOG) epileptiska aktiviteter och epilepsi inducerad sömnstörningar 7 . EA med en 100-Hz stimulering frekvens försämras ytterligare epileptiska aktiviteter och sömnstörningar hos råttor 8,9. Denna framgångsrika experiment beror på tre faktorer: för det första, en möjlig epileptiskt djurmodell; för det andra, en metod för sömn registrering och analys i gnagare; och för det tredje, den exakta prestanda akupunktur och noggrannheten i acupoint locations.
Epilepsi har kategoriseras i två huvudtyper: fokal epilepsi och generaliserad epilepsi. Vi är intresserade av fokal Temporallobsepilepsi (TLE), generaliserad epilepsi, status epilepticus (SE), och återkommande spontana generaliserad epilepsi. Därför olika manipulationer tillämpas för att skapa lämpliga epileptiska modeller för våra experiment. Att upprätta fokal TLE, är en låg dos av pilokarpin administrerades i den vänstra centrala kärnan av amygdala (CEA). För att verifiera denna modell, är sex ECOG elektroder implanteras på den främre (F1 och F2), parietal (P1 & P2), och skallbenet (O1 och O2) lober i både vänster och höger halvklot, och ytterligare två referenselektroder (R1 & R2) placeras över lillhjärnan i båda halvkloten. En ytterligare mikroinjektion guide kanyl kirurgiskt implanteras i vänster CEA (AP, 2,8 mm från bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 mm i förhållande till bregma). Koordinaterna är anpassade från Paxinos och Watson råtta atlas 10. Om bränn TLE framgångsrikt induceras endast inspelningen från elektroden till vänster parietal cortex (P1), som ligger nära den vänstra CEA bör förvärva dominerande epileptiforma ECoGs, med inga signifikanta epileptiforma ECoGs som spelats in från andra ECOG elektroderna. Intraperitoneal (IP) injektioner av pilokarpin till råttor inducera generaliserad epilepsi och SE, men detta kan vara dödlig. Fem IP injektioner av pentylentetrazol (PTZ) med en dags intervall mellan varje injektion framgångsrikt inducera spontan generaliserad epilepsi hos möss och även se till mössens överlevnad. Två tråd ECOG elektroder implanteras i cortex frontal- och parietal i möss för att ta emot ECOG signaler och för att kontrollera spontant återkommande epilepsi.
Polysomnografi (PSG) är en omfattande metod för att registrera fysiologiska förändringar som sker under sömnen, och det kan objektivt klassificera sömn i olika stadier av icke-snabba ögonrörelser (NREM) och rAPID ögonrörelser (REM) sömn. PSG registrerar parametrar för kroppsfunktioner, inklusive hjärnvågor (elektroencefalogram, EEG), ögonrörelser (electrooculogram, EOG), skelettmuskel toner (elektromyogram, EMG), hjärtrytm (EKG, EKG), och blodet syre och respiratoriska parametrar. Hos råttor, vi spela ECoGs, EMGs, kortikal temperatur och rörelseaktivitet att klassificera vaksamhet stater i vakenhet, NREM sömn och REM-sömn. Sömn analys i möss genomförs med hjälp av ECoGs, EMGs och rörelseaktivitet resultat. Råttor inopererade med tre ECOG skruv elektroder vid den främre, parietalceller och kontra cerebellära cortex av stereotaktisk kirurgi. Efter förvärvet bestämning av vaksamhet stater (vakenhet, NREM sömn och REM-sömn) genomförs enligt de parametrar som förvärvats från ECoGs, EMG, hjärna temperatur och rörelseaktivitet. Detaljerade kriterier för att kategorisera djurets beteende i både råttor och möss beskrivs i than-protokollet.
Både råttor och möss måste bedövas med en låg dos av zoletil (25 mg / kg), vilket är hälften av doseringen av bedövningsmedel som normalt administreras under stereotaxisk kirurgi, innan han genomför manuell akupunktur eller EA. Denna dosering medger djur för att vakna upp 30 till 35 min efter injektionen. Antingen manuell akupunktur eller EA utförs vid början av den mörka perioden, med en konstant tidsperiod av 30 min, och varje djur i följd behandlas i två till tre dagar. Stimulerande EA strömmar levereras till en viss acupoint genom en rostfri stål nål som sätts in i acupoint. Stimulansströmmen är ett tåg av bifasiska fyrkantpulser, i vilka pulslängd är 150 ms och stimuleringsintensitet 1 mA. Om en torr nål används för manuell akupunktur, är nålen införd i akupunkturpunkterna ryckte 10 gånger varje 5 min. Den svåraste delen av manuell akupunktur eller EA är att lokalisera akupunkturpunkterna hos gnagare. LOCation av akupunkturpunkter hos råttor eller möss liknar deras anatomiska läge i människor. Till exempel är de bilaterala Fengchi akupunkturpunkter ligger 3 mm bort från den bakre mittlinjen på halsen, mellan de två öron, som liknar den anatomiska läge i människor 11. Vidare kan de akupunkturpunkter med låg impedans på huden ytterligare bekräftas. Simulerad akupunktur eller simulerad EA manipulation är nödvändig för akupunktur eller EA experiment. Simulerad akupunktur eller simulerad EA bör utföras vid en icke-acupoint ligger nära acupoint, såsom nära armhålan 12.
För att framgångsrikt undersöka effekterna av akupunktur eller EA om epilepsi och epilepsi inducerad sömnstörningar, måste följande faktorer vara på plats: en möjlig epileptisk djurmodell, den exakta analysen av epileptiforma ECoGs och återfall av epilepsi, en metod för att klassificera vaksamhet stater och korrekt utförande av akupunktur eller EA i gnagare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) av National Taiwan University.
1. Stereotaxic kirurgi för implantering ECOG Elektroder, EMG Elektroder, Brain termistor, och Injection Guide kanyl
- För råttor (250-350 g, 6- till 8 veckor gamla Sprague-Dawley)
- Söva råttorna med IP-injektion med 50 mg / kg zoletil. Bekräfta rätt djup av anestesi genom att observera en brist på svar efter nypa baktassen. Applicera ögonsalva, raka pälsen, och sterilisera huden med povidon-jodlösning och 75% etanol. Injicera ett antibiotikum (penicillin G) för att förhindra infektion.
- Förbered skalpeller, saxar, peanger, gasväv och cautery maskin för operation. Sterilisera kirurgisk utrustning och gasväv av en autoklav och diatermi med 75% etanol.
- Placera ett öra bar i hörselgången och montera råtta till Stereotaxis.
- Använder sig aven skalpell, gör en ungefärlig 2-cm mittlinje snitt på skallen längs en linje mellan två öronen, flytta kaudalt. Clip flikarna huden med peanger för att exponera skallen och ta bort vävnaden över skallen med en skalpell.
- Borra åtta hål (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1 och R2), varvid varje approximativt 0,7 mm i diameter, på skallen med ett roterande verktyg. Skruv åtta ECOG elektroder på front, parietal och occipitallob och lillhjärnan i både vänster och höger halvklot. Dessa elektroder används för fokal epilepsi detektering.
- Använd följande koordinater för inspelningen elektroderna: frontal (F1 och F2): 2,0 mm främre till bregma och 2,5 mm från mittlinjen, parietalceller (P1 och P2): -2,0 mm främre till bregma och 3,0 mm från mittlinjen och skallbenet (O1 och O2): -5,5 mm främre till bregma och 3,0 mm från mittlinjen.
- Placera två referenselektroder (R1 och R2) över lillhjärnan (-11,0 mm främre till bregma och 4,0 mm från midline).
- I en separat grupp av råttor, borra tre hål och placera två skruv EEG elektroder över den högra främre (F2) och hjässloberna (P2) av cortex med samma koordinater som beskrivs i steg 1.1.5.1. Placera en tredje EEG över vänstra lillhjärnan (R1), som tjänar till att jorda djuret och minska signalartefakter. Dessa elektroder används för att bekräfta generaliserad epilepsi och analysera vaksamhet steg.
- Separera nackskinnet och muskler och infoga två EMG elektroder i halsmuskeln.
- Borra ett hål på skallen och placera en mikroinjektion guide kanyl i den vänstra CEA (AP, 2,8 mm från bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 mm i förhållande till bregma) i råttor. Koordinaterna är anpassade från Paxinos och Watson råtta atlas 10.
- Borra ett större hål (med en diameter på 1,6 mm) på skallen och sätta in en kalibrerad 30-kV termistor på ytan av den parietala cortex, som kommer att cementeras senare, för att Monitor den kortikala temperaturen hos råttor.
- Använd gasväv och diatermi att stoppa blödning när den inträffar.
- Route de isolerade ledningarna från ECOG elektroderna och EMG elektroder till en piedestal och ansluta termistorn till tjudret. Cement sockeln och vägleda kanyl till skallen med dentala akryl.
- Behandla snittet lokalt med Polysporin (zinkbacitracin / polymyxin B-sulfat) för att förhindra infektion. Ge djuren både ibuprofen och penicillin G i vatten för en vecka efter operationen.
- För möss (20-30 g, 6- till 8-veckor gamla C57BL / C möss)
- Söva möss genom IP-injektion med 50 mg / kg zoletil och bekräfta det korrekta djupet av anestesi genom att observera en brist på respons efter klämmande baktassen. Applicera ögonsalva. Efter rakning av pälsen, sterilisera huden med povidon-jodlösning och 75% etanol. Injicera ett antibiotikum (penicillin G) för att förhindra infektion.
- Placera ett öra bar i hörselgången ochmontera musen till Stereotaxis.
- Med hjälp av en skalpell, gör en ungefärlig 1,5 cm mittlinje snitt på skallen längs en linje mellan de två öronen, flytta kaudalt. Clip flikarna huden med peanger för att exponera skallen och ta bort vävnaden över skallen med en skalpell.
- Peta två hål på skallen med kirurgisk sax och placera två tråd ECOG elektroder på den högra frontalloben (F2: +2,0 mm bregma och 1,5 till mittlinjen) och vänster parietal lob (P1: -3.0 mm bregma och -2,5 mm med mittlinjen).
- Separera nackskinnet och muskler och infoga två EMG elektroder i halsmuskeln.
- Anslut isolerade ledningar från tråd ECOG elektroder och EMG elektroder till de kvinnliga terminaler och en 2,54 mm kontakt, och sedan cement till skallen med dentala akryl.
- Behandla snittet lokalt med Polysporin (zinkbacitracin / polymyxin B-sulfat) för att förhindra infektion. Ge djuren både ibuprofen och penicillin G i vatten för en week efter operationen.
- Låt alla djur att återhämta sig under sju dagar före inledningen av experimenten.
- House råttor eller möss separat i individuella inspelnings burar, i isolerat rum där temperaturen hålls vid 23 ± 1 ° C och ljuset: mörker (L: D) rytm styrs i en 12: 12-timmarscykeln (40 W x 4 rör belysning). Ge mat och vatten ad libitum.
- Anslut ECOG, EMG, och termistorn genom en tjuder till förstärkarna en vecka efter operationen för att starta inspelningarna.
2. Upprättande av Focal TLE epilepsi, SE, och spontant återkommande Epilepsi
- för råttor
- Administrera 0,5 mikroliter av pilokarpin (2,4 mg / l) i den vänstra CEA genom injektionsstyrkanylen genom att använda en mikroinjektion pump. Insprutningshastigheten bör sättas vid 0,2 ml / min för att framkalla bränn TLE.
- IP injicera 300 mg / kg av pilokarpin att inducera generaliserade epilepsy med återkommande SE.
- för möss
- IP administrera PTZ (0,035 mg / g mus kroppsvikt) vid en viss ZT punkt varannan dag. Fem på varandra följande injektioner kommer att orsaka utveckling av spontant och återkommande generaliserad epilepsi.
- För både råttor och möss
- Förstärker de ECOG signaler från 5000 och filtrera analoga bandpass mellan 0,1 och 40 Hz.
- Använda en A / D-omvandlande bräda för att omvandla de analoga ECoGs signaler till digitala signaler med en 128-Hz samplingsfrekvens.
- Använd en programvara för visuell poängsättning och analysera uppkomsten och varaktigheten av epilepsi. Mät tidsskalan för att representera längden.
- Definiera ECOG epilepsi genom uppkomsten av epileptiska spikar med amplituder större än 2 mV och med löptider på mer än 30 s 13.
3. Klassificering av Vigilance States
- för råttor
- Bestäm vaksamhet stater genom att använda parametrar som förvärvats från ECoGs, EMG, hjärn temperaturer och rörelse inom en 12-s avsnitt av inspelningen. Anslut ECOG, EMG, och termistorn genom en tjuder till förstärkarna en vecka efter operation för att starta inspelningen. Betyg tillstånden med en skräddarsydd mjukvara enligt steg 3.1.5 - 3.1.7.
- Mät rörelseapparaten verksamheter som använder en infraröd rörelsedetektor, integrera signalerna var 1 s, och lagra signaler.
- Mät kortikal temperatur och lagra signaler.
- Klassificera vaksamhet stater i enlighet med våra tidigare definierade kriterier 14.
- Betyg vakenhet med följande egenskaper: liten amplitud ECoGs med högfrekvent spektra, högre delta effekt (0,5-4,0 Hz), och lägre theta effekt (6,0-9,0 Hz); dominerande rörelseaktivitet; hög EMG-aktivitet; och gradvis ökande kortikala temperatur.
- Betyg NREM sömn med hjälp av following egenskaper: delta-våg dominerande ECoGs med stora amplituder, minskade EMG-aktivitet, minskad kortikal temperatur, och ingen rörelseaktivitet.
- Betyg REM-sömn med hjälp av följande egenskaper: minskad amplitud av ECoGs med den dominerande theta frekvensen plötsligt ökad kortikal temperatur, minimal EMG-aktivitet och låg rörelseaktivitet med kropps ryckningar.
- för möss
- Upprepa klassificeringen av vaksamhet stater i mössen som genomfördes i råttorna, förutom att det inte finns någon kortikala uppmätta temperaturen från termistorn.
4. Utförande av manuell akupunktur och EA i råttor
- Råttan bedövas för EA-protokollet.
- Leta upp acupoint av anatomi och bekräfta låg hud impedans på akupunkturpunkt. Lampan blinkar när upptäcka låg hud impedans. Obs: Fengchi akupunkter ligger 3 mm från den bakre mittlinjen varapolera de två öron, på halsen.
- Infoga rostfritt stål nålar i akupunkturpunkterna på ett djup av 2 mm.
- Rycka de insatta nålar 10 gånger varje 5 min.
- Med hjälp av en funktionell elektrisk stimulator, leverera ett tåg av bifasiska pulser (150-ps varaktighet vardera) med en intensitet av 1 mA till akupunkturpunkterna genom nålen.
- Utföra en simulerad akupunktur eller simulerade EA som en kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finns olika rått- och musmodeller för att tillgodose behoven hos olika epilepsityper. För att inducera fokus TLE, 0,5 mikroliter av pilokarpin (2,4 mg / l) administreras i den vänstra CEA. De dominerande epileptiforma ECoGs förvärvas från ECOG elektroden på Hjässloben av vänster hjärnhalva (Figur 1A: b), och sällsynta epileptiska aktiviteter plockas upp från resten av ECOG elektroderna (Figur 1A: a, c, d, e och f) när pilokarpin administreras. Epileptiforma ECoGs främst registreras omedelbart efter pilokarpin administration. Dessa resultat antas från 8. Dessa resultat tyder på en framgångsrik induktion av fokal TLE i råttor efter direkt injektion av låg dos pilokarpin i CEA.
Inom fem minuter, IP iprojicerings av 300 mg / kg pilokarpin inducerar allvarliga kolinerga effekter på beteendet, såsom piloerektion, salivering, röda ögon, frossa och ansikts automatism. Svårighetsgraden av dessa beteendemässiga tecken gradvis ökar tills en ECOG generaliserad beslag sker (Figur 1B, blå rutan). SE förekommer också efter generaliserad epilepsi (Figur 1B, röd ruta). Dessa resultat antas från 13. Våra resultat tyder på att en IP-injektion av 300 mg / kg pilokarpin är en tillförlitlig metod för att inducera ECOG-dokumenterad generaliserad epilepsi och SE. Emellertid är överlevnadsgraden efter SE utveckling mellan 15% och 20%. PTZ-tända modell av epilepsi hos möss används för att utveckla spontant och återkommande generaliserad epilepsi. PTZ vid en dos av 0,035 mg / g mus kroppsvikt är IP injiceras vid en viss ZT punkt (t.ex. i början av den mörka perioden, ZT13) är varannan dag, och varje injektion åtskilda av en en-dagars intervall. Det finns ingen epileptiformECoGs hittades under den mörka perioden efter 1: a injektion av PTZ (Figur 1C: a) eller under följande mörka perioden, när det är en av dag för injektion (Figur 1C: b). Ingen signifikant epileptisk aktivitet påträffas efter 2: a, 3: e, och 4: e injektionerna (data ej visade här). Emellertid är epileptiforma ECoGs induceras efter den 5: e PTZ injektion (Figur 1C: c och d), tillsammans med spontant och återkommande generaliserad epilepsi (Figur 1C: e och a ').
Vi klassificerade vaksamhet stater i vakenhet, NREM sömn och REM-sömn enligt de kriterier vi nämnde i protokollet. Vakenhet visuellt poängsätts av desynchronized ECoGs med låg amplitud och hög frekvens. De effektdensitetsvärdena i deltat frekvensbandet (0,5-4 Hz) är i allmänhet större än de itheta frekvensbandet (6-9 Hz) under vakenhet och mer högfrekvent spektra (> 10 Hz) finns. Vakenhet uppvisar en hög amplitud EMG och massor av rörelseaktivitet. Dessutom ökar gradvis kortikal temperatur när vaksamhet statliga transit från antingen NREM sömn eller REM-sömn till vakenhet (Figur 2). NREM-sömn kännetecknas av synkroniserade ECoGs med hög amplitud och låg frekvens. Effekttätheten värden dominerar i delta frekvensbandet. EMG amplituden gradvis avtar, och ingen rörelseaktivitet uppvisas under NREM sömn. Kortikala temperaturen sjunker när vaksamhet statliga transit från vakenhet till NREM sömn (Figur 2). Under REM-sömn är ECOG våg desynchronized, amplituden reduceras sker övervägande EEG effekttätheten inom theta frekvensen (6,0-9,0 Hz), EMG-aktivitet är lägst, phasic kropp rycka observeras, och kortikala temperatur ökar snabbt(Figur 2).
Vi demonstrerade de distinkta effekterna av EA på epileptisk aktivitet när EA stimulerar Fengchi akupunkter med antingen en högfrekvent stimulering (100 Hz) eller en lågfrekvent stimulering (10 Hz). I figur 3A, ett mikroinjektion av 0,5 mikroliter av pilokarpin (2,4 mg / | il) i den vänstra CEA inducerar fokal TLE, såsom tidigare (B) som nämnts. Men 100-Hz EA bilaterala Fengchi akupunkter förvärrar pilokarpin-inducerad epileptiforma ECoGs (C). Dessa resultat är anpassade från 8. I motsats, 10 Hz EA bilaterala Fengchi dämpar pilokarpin-inducerad epileptiforma ECoGs (Figur 3B: C). Dessa resultat är anpassade från 7. Administration av pilokarpin i vänster Cea trycker också NREM-sömn under den ljusa perioden för 12-h ljus: mörker-cykel (figur 4A och 4B). Minskningen av NREM sömn under afya timmar den mörka perioden beror främst på effekten av anestesi, och är inte en direkt effekt av EA 15. Tillämpning av 100-Hz EA försämras ytterligare pilokarpin-inducerad suppression av NREM sömn (Figur 4A). Däremot ökar en 10-Hz EA bilaterala Fengchi akupunkter NREM sömn sig under den mörka perioden och blockerar pilokarpin-inducerad reduktion av NREM sömn under den ljusa perioden (Figur 4B). Dessa resultat antas från 9.
Figur 1: Olika Epilepsi modeller hos råttor och möss. A visar i fokus TLE i råttor. B belyser generaliserad epilepsi med SE hos råttor. C indikerar de spontana och återkommande epileptiforma ECoGs. (A) (a), (b), (c), (d), (e) och (f) representerar EKugge signaler inspelade från elektroder placerade på den vänstra främre, vänster parietal, vänster occipital, höger frontal, rätt parietal, och höger occipital cortex, respektive. (B) Pilen anger IP-injektion av pilokarpin. Den grå rutan (a) visar de grundläggande ECoGs erhållits före pilokarpin injektionen. Den blå rutan visar epileptiforma ECoGs av generaliserad epilepsi. Den röda rutan (b) representerar SE. De ECOG signalerna som extraheras från (a) och (b) visas i (a ') och (b'). (C) (a) representerar ECoGs förvärvats efter den 1 PTZ injektion och (b) representerar ECoGs registreras dagen efter den 1 PTZ injektion i möss. Epileptiska aktiviteter inträffar efter 5: e PTZ injektion (c) och efteråt. De återkommande epileptiska ECoGs som inträffar dagen efter 5: e PTZ injektion visas i (d). De återkommande epileptiska ECoGs inspelade 5 dagar efter den 5: e PTZ injektion visas i (e) . Siffran längst ned (a ') representerar ECoGs extraherats från den röda rutan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Klassificering av vaksamhet stater: vakenhet NREM sömn och REM-sömn. Vaksamhet tillstånd råttor klassificeras av parametrarna från ECoGs, ECOG spektra, EMGs, rörelseaktivitet, och kortikal temperatur. Vaksamhet tillstånd möss kännetecknas av samma parametrar, utom kortikal temperatur är inte tillämplig.
Klicka här för att se en större version av denna siffra.
pload / 54896 / 54896fig3.jpg "/>
Figur 3: Effekterna av 100 Hz och 10 Hz EA på epilepsi. I (A), demonstrerar den första ECOG trace de utgångs ECoGs (a). Mikroinjektion av pilokarpin i vänster CEA inducerar fokala TLE (b). Tillämpning av 100-Hz EA vid bilaterala Fengchi acupoints förvärrar epileptiforma ECoGs (c). I (B) visar den första ECOG spår baslinjen ECoGs (a). Mikroinjektion av pilokarpin i vänster CEA inducerar fokala TLE (b). Tillämpningen av 10-Hz EA vid bilaterala Fengchi acupoints trycker de epileptiforma ECoGs (c). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effekter av 100 Hz och 10 Hz EA på Epilepsy-inducerad sömnstörningar. (A) Focal TLE induceras av mikroinjektion av pilokarpin i vänster Cea minskar NREM-sömn under den ljusa perioden. 100 Hz EA försämras ytterligare epilepsi-inducerad sömnstörning. (B) Tillämpningen av 10-Hz EA blockerar epilepsi-inducerad reduktion av NREM sömn under den ljusa perioden. Vidare 10 Hz EA ökar NREM-sömn under den mörka perioden. Värdena representeras som medelvärde ± SEM. Den svarta cirkeln representerar värden som uppmättes före mikroinjektion av pilokarpin, skildrar öppen cirkel de uppgifter som erhållits efter pilokarpin injektion och den öppna triangeln visar värdena erhållna efter EA stimuli. Den svarta stapeln representerar den mörka perioden av den 12-h ljus: mörker-cykel, och det vita fältet visar ljusperiod. * Representerar statistisk skillnad mellan 100 Hz EA + pilokarpin gruppen och kontroll (ANOVA, P <0,05) och # anger den statistiska skillnad näre mellan 10 Hz EA + pilokarpin grupp och pilokarpin-gruppen (ANOVA, p <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att välja en genomförbar epilepsi djurmodell är en förutsättning för varje experimentell ändamål. Ett av våra mål är att belysa effekterna av EA på epilepsi förtryck. EA är en alternativ medicin som kan uppvisa terapeutisk effekt vid epilepsi och har dokumenterats i gammal kinesisk litteratur. Men det finns en brist på vetenskapliga bevis för att bevisa det. För att bestämma effekterna av EA på epilepsi, fokuserade vi främst på effekterna av EA på mild fokal epilepsi, snarare än på svår generaliserad beslag eller SE. Vår tidigare studie använde en samlingspunkt TLE modell i råttor för att visa effekterna av lågfrekventa (10 Hz) och hög frekvens (100 Hz) EA bilaterala Fengchi akupunkter på pilokarpin-inducerad bränn TLE och bränn TLE-inducerad sömnstörningar 7- 9. Våra resultat tyder på att 10-Hz EA bilaterala Fengchi akupunkter trycker fokus TLE och sömnstörningar, medan 100-Hz EA förvärrar både fokal TLE och TLE-inducerade sömnstörningar. Ett annat exempel är to visa effekterna av djup hjärnstimulering på eldfast epilepsi, speciellt generaliserade anfall och SE. Vi bestämde att ensidiga djup hjärnstimulering av den främre kärnan i thalamus (ANT) med hög frekvens och lågintensiva strömmar hämmar framgångsrikt återkommande generaliserad epilepsi och varaktigheten av SE 13. Vi utvecklade också spontant och återkommande generaliserad epilepsi med hjälp av PTZ-tända metod hos möss. Denna PTZ-tända modell kan i stor utsträckning för epilepsistudier. Det kritiska steget för att etablera dessa epilepsimodeller är användningen av lämpliga doser. En mikroinjektion av större mängder pilokarpin till CEA kan utveckla sekundär generaliserad epilepsi. IP administration av mer än 300 mg / kg pilokarpin inducerar generaliserad epilepsi och SE; Men de flesta råttor inte överleva efter SE utvecklas. Dessutom doser lägre än 280 mg / kg kunde inte framgångsrikt etablera generaliserad epilepsi och SE. Samma situation händer med PTZ-tända modell. Större doser av PTZ kan orsaka SE, men många möss överlever inte. Däremot låga doser av PTZ kräver flera injektioner för att etablera spontant återkommande epilepsi.
Klassificeringen av olika vaksamhet stater i råttor och möss är huvudsakligen baserad på egenskaperna hos polysomnografi spelats in från människor. Vi ändrade protokollet för att analysera sömn-vakna aktivitet genom de värden som registrerats från ECOG, spektralfördelning, EMG, rörelseaktivitet, och kortikal temperatur. Egenskaperna hos ECOG, spektralfördelning, EMG, rörelseaktivitet, och kortikala temperatur inspelade från vakenhet och NREM sömn liknar de som förvärvats från människor. Dock är REM-sömnen ibland tvetydiga och svåra att klassificera i gnagare. Mest litteratur beskriver REM-sömn hos gnagare i enlighet med dess ECoGs och EMGs. Theta frekvensband ECoGs är dominerande och muskeltonus i EMG är lägst när råttor eller möss enär i REM-sömn. För att öka förtroendet för scoring REM-sömn, vi spelade ytterligare rörelseaktivitet och kortikala temperatur. Phasic kropp rycka observeras och kortikala temperatur ökar snabbt när råttor anger REM-sömn. Rörelseaktivitet och kortikalt temperatur, förutom de ECoGs, spektralfördelning och EMGs, förbättra noggrannheten för REM-sömn-analys. Ju fler parametrar som ingår, kan mer exakta klassificeringar göras.
Två huvudpunkter har alltid kritiserats när forskare utföra manuell akupunktur eller EA experiment. Den första frågan är hur forskarna identifiera och bekräfta akupunkter hos råttor. Meridiansystemet och akupunkter hos människa är väl etablerade, men det finns ingen meridiansystemet och acupoint karta bekräftats hos gnagare. Därför är lokaliseringen av motsvarande akupunkturpunkter hos gnagare bestämdes enligt den relativa anatomisk position. Till exempel, Fengchi akupunkturpunkter (GB 20) ärbeläget i fördjupningen mellan den övre delen av musculus sternocleidomastoideus och musculus trapezius hos människor. Vi hittade relaterade anatomiska läge i gnagare och ytterligare bekräftat det genom att mäta låga hud impedans. Impedansen hos en akupunkturpunkt är lägre än den hos den omgivande huden. Den andra frågan är hur akupunktur doserna kontrolleras under experimentet. Om manuell akupunktur används för experimentet, bör manipulering av ryckningar nålen utföras av samma forskare på samma sätt för varje manipulation. Det skulle vara lättare att styra akupunktur dosen om EA är tillämplig, eftersom EA säkerställer en konsekvent stimulering frekvens och strömstyrka. Vidare i smärtlindring uppvisar EA mer effektivitet än manuell akupunktur 16. Emellertid kan manuell akupunktur och EA med låg frekvens och högfrekvent stimulering på samma acupoint aktivera olika hjärnregioner 17, vilket kan innebära olika underliggande fastighetsing mekanismer.
Sammanfattningsvis visar flera kemiska-inducerad epileptiska modeller i råttor och möss, inklusive fokal TLE, generaliserad epilepsi, SE, och spontant och återkommande generaliserad epilepsi detta dokument. Vi har också etablerat den traditionella och snabba elektriska tändved epileptiska modell i råttor. Om läsarna är intresserade av elektriska tända modell, se referenserna 4 och 5. Vi tillhandahåller också kriterier för att analysera sömn-vakna aktivitet hos råttor och möss. För att utvärdera effekten av EA på epileptisk aktivitet och sömn, beskriver vi hur man lokalisera relaterade akupunkter hos råttor och hur man utför akupunktur och vi också presentera några representativa resultat för att visa effekterna av EA på epilepsi och epilepsi inducerad sömnstörningar .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X.
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W.
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , Academic Press. San Diego. (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at 'Anmian' (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), Pt 2 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
