Abstract
В данной работе сообщается микрожидком устройство, изготовленное из полидиметилсилоксана (PDMS) со встроенным поликарбоната (ПК) тонкой пленки для изучения миграции клеток при комбинации химических и кислорода градиентов. Оба химических и кислородные градиенты могут сильно повлиять на миграцию клеток в естественных условиях; Тем не менее, из - за технических ограничений, очень мало исследований было проведено , чтобы исследовать их эффекты в пробирке. Устройство разработано в этом исследовании использует преимущества серии серпентин-образных каналов для генерации желаемые химические градиенты и эксплуатирует пространственно ограниченных метод химической реакции для генерации градиента кислорода. Направления химических и кислорода градиентов перпендикулярны друг к другу, чтобы обеспечивать возможность прямого толкования результатов миграции. Для того, чтобы эффективно генерировать градиенты кислорода с минимальным химическим потреблением, встроенный ПК тонкая пленка используется в качестве диффузионного барьера газа. Разработанное устройство Микрожидкостныхможет быть приведен в действие с помощью шприца насосов и помещают в обычный электролизер инкубаторе во время миграции клеток экспериментов, чтобы обеспечить настройки упрощения и оптимизированных условий для культивирования клеток. В экспериментах с клетками, мы использовали устройство для изучения миграции adenocarcinomic альвеолярных базальных эпителиальных клеток человека, А549, при комбинации хемокина (стромальных клеток, полученных фактор, SDF-1α) и кислородные градиенты. Экспериментальные результаты показывают, что устройство может устойчиво генерировать перпендикулярные хемокинов и кислородные градиенты и совместим с клетками. Результаты миграции исследования показывают, что кислородные градиенты могут играть существенную роль в руководстве миграции клеток и клеточного поведения в условиях сочетания градиентов не могут быть предсказаны от тех, по разовым градиентов. Устройство обеспечивает мощный и практичный инструмент для исследователей для изучения взаимодействия между химическими и кислородных градиентов в культуре клеток, что может способствовать лучшему исследования миграции клеток в более естественных условиях -как microenviботанное.
Introduction
Пространственное распределение растворимых факторов и напряжения кислорода может регулировать ряд важных клеточных функций в естественных условиях 1, 2, 3, 4. Для того , чтобы лучше исследовать их влияние на клетки, в пробирке клеточной культуры платформа способна стабильно генерировать химические и кислородные градиенты очень желательно. Различные растворимые факторы играют ключевую роль в биологической активности и влияют на клеточное поведение. В последнее время , в связи с продвижением микрофлюидальных методов, ряд микроканалов устройств , способных стабильно генерирующие химические градиенты, были разработаны для изучения миграции клеток 5. Кроме того, некоторые исследования также выявили необходимость напряжения кислорода в пробирке для клеточных культур 6, 7, 8. Однако,контроль напряжения кислорода для культивирования клеток в основном зависит от прямого химического кроме того, для поглощающих кислород или клеточных инкубаторах с давлением газовых баллонов. Прямое химическое добавление изменяет среду для культивирования клеток и влияет на клеточные ответы. Кислородная управления инкубаторы требуют специальной конструкции инкубатора, точный контроль потока газа, а также большой объем газообразного азота с целью достижения условий гипоксии. Кроме того, она является недопустимой контролировать пространственное распределение кислорода, используя эту установку, которая замедляет исследование клеточного поведения при различных напряжения кислорода и градиентов. Для преодоления этих ограничений, ряд микроканалов устройств были разработаны для генерации кислородных градиентов для клеточных культур 9. Тем не менее, большинство из них работают с использованием газов под давлением, которые могут вызвать испарение и проблемы образования пузырьков. Поэтому они часто требуют сложное оборудование и не может быть надежным для длительного культивирования клеток Studies.
Для того, чтобы преодолеть проблемы и для дальнейшего изучения взаимодействий между химическими и кислородных градиентов для миграции клеток, мы разработали микрожидкостных устройство для культивирования клеток , изготовленный из полидиметилсилоксана (PDMS) со встроенным поликарбоната (ПК) тонкой пленки 10. Устройство состоит из двух микроканалов канальных слоев, разделенных мембраной PDMS. Верхний слой представляет собой ПДМС-ПК слой для генерации градиента кислорода; нижний слой изготовлен из PDMS для химического производства градиента и в клеточной культуре. Устройство может одновременно генерировать перпендикулярные химические и кислородные градиенты без использования газовых баллонов и систем управления потоком сложных. В устройстве, ПДМС обеспечивает большую оптическую прозрачность, газопроницаемость и биологической совместимости для культуры клеток и визуализации. Встроенный ПК пленка служит диффузионным барьером газа для эффективного управления парциального давления кислорода. В микрожидком канале, мы использовали ряд змеевика в форме каналаs генерировать химические градиенты. Конструкция была широко использована для создания химических градиентов в микрожидкостных устройств для различных областей применения благодаря своей надежности и простоты экспериментальной установки. Кроме того, профили химического градиента могут быть разработаны путем изменения геометрии канала заранее с численным моделированием. Для генерации градиента кислорода, мы воспользовались пространственно ограниченного метода химической реакции , который ранее был разработан в лаборатории 10, 11, 12. Кислород может быть продуваемых из специально отведенных местах без продувки азотом. Для практического использования в биологических лабораториях, вся экспериментальная установка совместима с обычными инкубаторами клеточных культур. Интегрируя эти методы, мы можем одновременно генерировать стабильные химические и кислородные градиенты без объемных газовых баллонов и сложного оборудования для изучения миграции клеток.
Protocol
1. Изготовление микрожидкостных устройств
Примечание: Весь Микрожидкостных устройство изготавливается с использованием мягкого процесса 13 формования литография реплики.
- Изготовление пресс - форм для слоев PDMS в микрожидком устройстве
- Дизайн Микрожидкостных модели канала с использованием коммерчески доступного иллюстрации или рисования программное обеспечение. Добавить файл в компании с высоким разрешением прозрачности фотошаблона печати 14.
- Чистые кремниевые пластины с ацетоном (≥99.5%), изопропиловый спирт (ИПС; ≥99.9%) и буферным оксидом травление (БОЭ; 6: 1 NH 4 F.HF). Промойте деионизированной (ДИ) водой и обезвоживают пластину с ружьем азота.
- Спин пальто приблизительная 20 г отрицательного тона фоторезиста, SU-8 2050, на подложках при 500 оборотах в минуту в течение 15 секунд, а затем 2000 оборотов в минуту в течение 30 сек.
Примечание: Состояние спинового покрытия должно дать SU-8 2050 года фотосопротивление слоев толщиной примерно 75 мкм на подложках после оптической литографии. - Мягкие выпекать пластины на 65 ° C плитке в течение 3 мин, а затем при 95 ° С в течение 9 мин. После мягкого выпекать, разоблачить вафель с помощью маски Aligner с проектируемых масок прозрачности под УФ-светом; полная энергия экспозиции должна составлять около 300 мДж / см 2. Постэкспозиционная запекать (ПЭБ) пластины при 65 ° С в течение 2 мин, а затем при 95 ° С в течение 7 мин.
- После ПЭБ, погружают вафли в СУ-8 разработчик с сильным перемешиванием или в ультразвуковой ванне (37 кГц и 180 Вт эффективной мощности ультразвука) в течение 7 мин. Промыть пластины с ацетоном и ИПС с целью удаления остаточного SU-8.
- Поместите пластину и 100 мкл силана (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) в 6 см диаметром чашки Петри в эксикаторе, связанной с вакуумным насосом диафрагменного для поверхности полупроводниковой пластины силанизацией для того, чтобы предотвратить нежелательное склеивание. Включите насос в течение 15 мин, выключите его, И герметизировать эксикаторе с вакуумом в течение 30 мин.
- Возьмите силанизированы вафель из эксикаторе и ленты их до 15 см диаметром чашки Петри для следующего мягкого процесса литографии:
- Изготовление и монтаж PDMS слоев
- Подготовка PDMS форполимера
- Смешайте PDMS мономера (основа) и отвердитель в соотношении 10: 1 (об / об). Дегазировать смесь в установке эксикаторе в течение 60 мин.
- Изготовление верхнего слоя ПК встроен
- Передача 2 г PDMS предварительно полимера на пресс-форму с верхнего слоя жидкостных моделей канала, чтобы сделать тонкий слой PDMS. Поместите форму в установке сушилке, чтобы дегазировать PDMS в течение 60 мин.
- Поместите в течение ночи формы в духовке 60 ° C для PDMS отверждения. Убедитесь, что форма находится на горизонтальной плоскости.
- Охладите форму до комнатной температуры. Налить еще 13 г PDMS форполимера на форму и дегазировать PDMS в гое установки эксикаторе в течение 60 мин.
- Медленно встраивать толстую пленку PC 1 мм на свежий слой PDMS в качестве диффузионного барьера газа; изгнать любые пузыри, если это необходимо.
- Помещенный в течение ночи формы в 60 ° C духовке, и убедитесь, что он находится на горизонтальной плоскости.
- Охладить отвержденных PDMS до комнатной температуры. Обрежьте устройство с скальпелем площадью приблизительно 5,5 х 5 см 2, который может охватить все модели канала, и шелушиться плиты PDMS из формы.
- Перфорационных отверстий для входов и выходов с использованием трепанобиопсия 2 мм диаметра. Храните сфабрикованное верхний слой PDMS-PC от окружающей среды пыли для последующего монтажа.
- Изготовление нижнего слоя PDMS
- Налейте 11 г PDMS форполимера на форму для нижнего слоя. Поместите форму в эксикаторе, чтобы дегазировать PDMS в течение 60 мин. Держите в течение ночи формы в C духовке 60 °, чтобы вылечить PDMS. Убедитесь, что он лежит на горизонтальной плоскости.
- Охладить-ее ПДМС до комнатной температуры. Обрежьте устройство к площади примерно 5,5 х 5 см 2, что может охватить все шаблоны каналов, и очистить его от пресс - формы. Храните сфабрикованное нижний слой PDMS от окружающей среды пыли для последующего монтажа.
- Изготовление мембраны PDMS
- Спин пальто приблизительная 4 г PDMS предварительно полимера на силанизированном пустой пластины при 100 оборотах в минуту в течение 90 секунд, а затем 3000 оборотов в минуту в течение 4 сек. Выпекать пластины спин-покрытием в 60 ° С печи в течение ночи.
- Сборка устройства
- Поместите изготовленную PDMS-PC верхний слой и пластины с спин-покрытием PDMS мембраны в качестве 2 плазменной машины для обработки поверхности O с соединяемые поверхности лицевой стороной вверх. Лечить поверхности PDMS с 90 Вт O 2 плазмы в течение 40 сек.
- Бонду верхний слой на мембрану PDMS сразу после обработки поверхности плазмы O 2. Поместите вес (около 600 г) на верхней части склеенных слоев и поместить их в60 ° С печи в течение ночи, чтобы способствовать склеивание.
- Охладить соединенные слои до комнатной температуры и разрезать мембрану присоединенную к верхнему слою с скальпелем площадью приблизительно 5,5 х 5 см 2, что может охватить все шаблоны каналов. Слезьте монолитная структура из кремниевой пластины и пробивки отверстий на входах и выходе химического градиента канала с помощью трепанобиопсия 2 мм диаметра.
- Поместите мембранный-стружечных верхний слой и сфабрикованные PDMS нижний слой в O 2 плазменной машины для обработки поверхности, с соединяемые поверхности лицевой стороной вверх, чтобы активировать PDMS поверхности , используя плазму при 90 Вт в течение 40 сек.
- Закрепить верхний и нижний слои вместе для склеивания сразу после обработки поверхности. Поместите вес (около 600 г), в верхней части всего связанного устройства и поместить его в 60 ° C в печи в течение ночи.
- Возьмите всю изготовленную устройство из духовки и охладить его до комнатной температуры.
- Подготовка PDMS форполимера
2. Микрожидкостных Анализ миграции клеток
Примечание: В данной работе мы используем обычно используемый клеточную линию, adenocarcinomic человек альвеолярной базальной эпителиальных клеток (А549) и хемокинов, полученных стромальных клеток фактор (SDF-1 & alpha;), в качестве примеров. Для исследователей, работающих на других клетках и хемокинов, пожалуйста, настроить экспериментальные процессы соответственно.
- День 0: препарат клеток
- Культура запас A549 клеток в полной среде для роста, содержащей DMEM F12 L-глютамин заменителя, 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% (об / об) Antimicrob-противогрибковым раствором. Субкультура диссоциацией с 0,25% трипсин-ЭДТА.
- Готовят клеточные суспензии для экспериментов, при центрифугировании диссоциированных клеток при 140 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре. Для экспериментов микрожидкостных устройств, подсчет клеток с помощью гемоцитометра и семян по меньшей мере , 1 × 10 6 клеток в Т75 колбу с 10 мл полнойсредний рост.
Примечание: Все процессы культивирования клеток проводят в термостате с 37 ° С и 5% СО 2 атмосферы.
- День 1: Подготовка устройств
- Поместите устройство в плазменной машине O 2 и относиться к нему с O 2 плазмы при 90 Вт в течение 40 секунд , чтобы сделать Микрожидкостных канала поверхности гидрофильной.
- Сразу же после обработки поверхности, установить два 14 G тупые иглы, вставленной непосредственно иглы в отверстия диаметром 2 мм, пробитых в слой PDMS на входах каналов химического градиента. Убедитесь, что иглы не блокируют микроканалов. Draw 0,8 мл DDH 2 O с использованием 1 мл шприц с тупой иглой 14 G. Вводят DDH 2 O в химический градиент канала от выхода , пока вода не начнет вытекать из обеих игл на входах.
- Подготовка 1 мл 50 мкг / мл фибронектина раствора путем разбавления фибронектина запаса с Дульбекко & #39; s забуференный фосфатом физиологический раствор (DPBS).
- Настаивать фибронектин раствора из выпускного отверстия химического градиента канала с использованием 1 мл шприц с тупой иглой 14 G, пока раствор не начнет вытекать из обеих игл на входах.
- Инкубируют всю на ночь устройство в обычном инкубаторе для клеточных культур.
- День 2: Cell высева и микроскопии изображений
- Cell высева
- Аспирируйте среды из клеток, которые культивировали так как 0-й день и промыть клетки с 5 мл 2 раза DPBS. Аспирируйте DPBS, добавляют 2 мл трипсина-ЭДТА, и инкубировать клетки в инкубаторе в течение 5 мин, чтобы отделить клетки от поверхности колбы.
- Подождите, пока клетки отделяются и суспендируют в растворе и добавляют 8 мл сыворотки среде Игла (DMEM F12 + 1% (об / об) Antimicrob-противогрибковый раствор) в колбу. Передача всей жидкости в 15 мл коническую пробирку и центрифугировать ее при 140 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант после центрифугирования и добавить соответствующее количество бессывороточной среды , чтобы сделать окончательный плотность клеток 1 × 10 6 клеток / мл. Выньте микрожидкостных устройство, подготовленный на День 1. Граф клеток с использованием гемоцитометра или другого автоматического подсчета клеток инструмента.
- Вводят бессывороточной среды из выпускного отверстия химического градиента канала с использованием 1 мл шприц с тупой иглой 14 G, пока среда не будет вытекать из обеих игл на входах. Вводят 200 мкл клеточной суспензии из выходного отверстия химического градиента канала.
- Обратите внимание на камеру для культивирования клеток в устройстве под микроскопом, чтобы подтвердить, что клетки были введены в микрожидкостных канал. Поместите устройство во влажную контейнер (например, пластиковая коробка с DDH 2 O внутри) и держать его в культуре клеток инкубаторе в течение 5 часов , чтобы способствовать адгезии клеток на поверхности устройства.
- Получение КГНЭнты для генерации химического градиента
- Подготовка химического вещества (SDF-1 & alpha;) в нужной концентрации (100 нг / мл) в среде без сыворотки. Нарисуйте бессывороточной среды с и без химического вещества в двух отдельных 3 мл шприцы, соединенных с трубкой высокой чистоты. Установить шприцы на шприцевой насос со скоростью потока 1 мкл / мин для последующего использования.
- Приготовление реагентов для генерации градиента кислорода
- Сделать 15 мл 1 М раствора NaOH и 15 мл 200 мг / мл раствора пирогаллолом. Нарисуйте NaOH и Пирогаллол растворы на две отдельные 15 мл шприцев, соединенных с высокой чистоты из PTFE трубки и трубки высокой степени чистоты, соответственно. Установить шприцы на шприцевой насос со скоростью потока 5 мкл / мин для более позднего использования.
- Настройка устройства Микрожидкостных
- После 5 ч инкубации принимают все устройство, и поместить его на 15 см диаметра чашки Петри. Закрепите устройство в чашке Петри с использованием клеевой шпатлевкой. перечисления денежных средствПетри с живым микроскопом изображений клеток в инкубаторе.
- Соедините трубку от шприцев для генерации химического градиента на входы химического градиента канала. Подключите выход трубок, ведущих к резервуару отходов. Включите шприцевой насос с шприцами для производства химического градиента.
- Подключите трубку высокой чистоты из шприцев, содержащих NaOH и пирогаллол на входы градиента кислорода канала. Подключите трубку к выходному отверстию для сбора отходов. Включите шприцевой насос с шприцов для генерации градиента кислорода.
- Добавляют приблизительно 15 мл DDH 2 O в чашке Петри , чтобы держать устройство увлажненной. Настройка микроскопа живого изображения ячейки для захвата изображения в реальном времени истек, и сделайте снимок каждые 15 мин.
- Cell высева
- День 3: Сбор и анализ данных
- Передача захваченных файлов изображений на компьютер. Анализ изображений с использованием образа с открытым исходным кодомПрограммное обеспечение alysis, ImageJ, с открытым исходным кодом плагин для ручного отслеживания (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) и свободное программное обеспечение хемотаксиса Tool (http://ibidi.com/xtproducts / ен / Программно-Image-анализ / Руководство-Image-анализ / хемотаксис-и-Migration-Tool) 15, 16.
3. Характеристика градиентам
ПРИМЕЧАНИЕ: Химические и кислородные градиенты могут быть охарактеризованы до или после экспериментов клеток.
- Численное моделирование химического градиента
- Оценить характер ламинарного потока микрофлюидики с использованием вычислительной жидкостный динамики (CFD) моделирование.
- Экспериментальная характеристика градиента кислорода
- Приготовьте чувствительный к кислороду флуоресцентный краситель, трис (2,2'-бипиридил) рутений (III) хлорид гексагидрат, раствор в воде при концентрации 5мг / мл.
- Draw раствор красителя чувствительный к кислороду в два отдельных 3 мл шприцы, соединенных с трубкой высокой чистоты. Установить шприцы на шприцевой насос с расходом 1 мкл / мин (идентичной скорости потока, используемых для генерации химического градиента).
- Соедините трубку от шприца на входы химического градиента канала. Подключите выход трубок, ведущих к резервуару отходов. Включите шприцевой насос с шприцами для производства химического градиента.
- Измерение интенсивности флуоресценции с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа с возбуждающим светом, проходящим через 470 ± 20 нм, оптический фильтр. Собирают излучение света через фильтр длиной частот излучения в 515 нм, используя прохладную ПЗС-камеры.
- Подключите трубку высокой чистоты из шприцев, содержащих NaOH и пирогаллол на входы градиента кислорода канала. Подключите трубку к выходному отверстию для сбора отходов. Включите шприцевой насос с шприцов для кислородаГрадиент поколения.
- Сбор флуоресцентные изображения чувствительный к кислороду красителем, протекающей в камере для культивирования клеток.
- Остановить поток для генерации градиента кислорода и отсоедините все трубки к каналу генерирования кислорода. Подключение трубки высокой степени чистоты из газовых баллонов на выходе из градиента кислородного канала.
- Сбор флуоресцентные изображения чувствительный к кислороду красителем, протекающего в культуральную камере ячейки при потоке воздуха, чистого азота, чистого кислорода и в трубку, соединенного с градиентным кислородный канала.
- Оценить градиенты кислорода путем анализа флуоресцентных изображений с помощью уравнения Штерна-Фольмера в соответствии с рекомендациями 10 и 11.
Representative Results
Изготовленный PDMS-PC гибрид Микрожидкостных культуры клеток устройство. Инжир. 1 показывает фотографию и иллюстрацию микрожидком устройства. Нижний слой состоит из четырех уровней змеиных-образных каналов для генерации решений из реагентов, введенных из двух разделенных бухтах с шестью различными коэффициентами смешивания. Теоретически, шесть различных соотношений смешивания являются 1: 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4 и 0: 1 (слева направо) между двумя решениями, введенных из входных отверстий. Химические градиенты, построенные из шести различных растворов смешения соотношение может быть сгенерирован в клеточной культуральной камере, расположенной ниже по течению. Верхний и нижний слои разделены мембраной PDMS. В верхнем слое, реагенты для поглощающий кислород, химической реакции, вводят в микрожидком канал из двух отдельных входных отверстий. Реагенты смешивают друг с другом для реакции непосредственно перед протеканием в верхней части камеры для культивирования клеток дляпродувать кислород из нижнего канала без непосредственного химического контакта. Встроенный ПК пленки, с меньшим коэффициентом диффузии газа по сравнению с PDMS, действует как диффузионный барьер, который делает поглощающий кислород более эффективными. Кислород постепенно диффундирует обратно к клеточной культуральной камеры через PDMS в нисходящем области, чтобы сформировать градиент кислорода вдоль направления потока. Так как химическая реакция поглощать кислород пространственно ограничена, только локальные напряжения кислорода страдают. В результате, устройство может быть использовано в обычном инкубаторе клеток, не изменяя его глобального парциального давления кислорода. В миграционных экспериментов клетки высевают внутри камеры для культивирования клеток для наблюдения. Среда для роста и химические реактивы вводятся в устройство с помощью шприца насосы с точно регулируемой скоростью потока.
Характеристика химических и кислорода градиентов , генерируемое внутри устройства. Из-тон ламинарного течения характер микрофлюидики, поведение потока могут быть предсказаны с использованием вычислительной жидкостный динамики (CFD) моделирование. В данной работе мы построили 3D-модель и выполняется моделирование с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для моделирования Multiphysics. Инжир. 2 (а) показывает сравнение между экспериментально характеризуемых флуоресцеина профилей концентрации по всей ширине камеры для культивирования клеток на основе измерений интенсивности флуоресценции и результатами численного моделирования. Соглашение между экспериментальными и моделирования результатов свидетельствует о том, что модель CFD можно также оценить химические градиенты, генерируемые внутри устройства. Инжир. 2 (б) участки смоделированный градиент SDF-1alpha , генерируемого в камере для культивирования клеток. Инжир. 3 показаны результаты определения характеристик градиента кислорода пропусканием чувствительный к кислороду флуоресценции красителя внутри клеточной культуральной камеры до экспериментов клеток. Результат показывает, что GRADI кислородалор, в диапазоне от около 1 до 16%, может быть установлена с использованием вышеупомянутого протокола.
Результаты миграции клеток. В качестве демонстрации, мы провели A549 исследования миграции клеток при 4 комбинации хемокина (SDF-1 & alpha;) и кислорода градиентов: (1) отсутствие хемокина и отсутствие кислорода градиенты в качестве контроля, (2) с градиентом хемокинов и без градиента кислорода, (3) с градиентом кислорода и без градиента хемокинов, и (4) с обеих хемокина и кислородных градиентов. Инжир. 4 показывает фотографию всей экспериментальной установки. Эксперименты были выполнены в традиционной клеточной культуры инкубатор со всей установки (в том числе Микрожидкостных устройств, шприцевые насосы, а также микроскопов живых изображений клеток), размещенных внутри нее. Результаты миграции клеток показаны на рис. 5. Инжир. 5 (а) показывает изображения , полученные в ходе экспериментов с использованием клеток живого изображения анализатор, а на рис. 5 (б) и (с) выражает зависимость миграции клеток траектории и средние движения в рамках четырех комбинаций анализируемых ImageJ программного обеспечения с помощью плагинов. Результаты показывают, что среднее расстояние миграции клеток в контроле приближается к нулю, что указывает на случайное движение клеток в эксперименте. В противоположность этому, только с градиентом хемокинов, среднее движение клеток к левой стороне, где концентрация SDF-1α, что выше. Полученные результаты свидетельствуют о SDF-1 & alpha; хемотаксис поведение клеток A549, которые были ранее. В эксперименте с только градиенты кислорода, среднее движение клеток вверх, где парциальное давление кислорода ниже. Более интересно, в эксперименте с перпендикулярными хемокинов и кислородных градиентов, среднее движение клеток вверх и без какого-либо очевидного движения в горизонтальном направлении (хемокин направления градиента).
Рисунок 1: Изготовленный PDMS-PC устройства Микрожидкостных культуры клеток. (А) Экспериментальное фото изготовленного устройства , способного надежно генерировать перпендикулярные химические и кислородные градиенты для миграции клеток исследований. Канал химический градиент заполнен синим и желтым пищевых красителей, чтобы продемонстрировать градиентной поколение внутри камеры для культивирования клеток. Градиент канал кислород заполнен красным пищевым красителем. Шкалы составляет 1 см. (Б) Схема микрожидкостных устройства. Верхний слой изготовлен с использованием PDMS со встроенным ПК слоем в качестве диффузионного барьера газа для эффективного управления градиента кислорода внутри клеточной культуральной камеры. (С) мастер - формы для изготовления верхнего и нижнего слоев. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобыпросмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Химический градиент внутри устройства микрожидком для культивирования клеток. (А) Представлены результаты численного моделирования и экспериментально характеризуется флуоресцеина градиент концентрации внутри клеточной культуральной камеры по всей ширине камеры для культивирования клеток (Y - направление). Сходство между имитацией и экспериментально измеренных градиентов указывает на то, что моделирование может хорошо предсказать химический градиент. На рисунке врезке показана трехмерная модель (3D), построенную для моделирования. (Б) результат Численное моделирование SDF-1 & alpha; хемокинов градиента по ширине камеры для культивирования клеток для миграции клеток исследований. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотраБольшая версия этой фигуры.
Рисунок 3: Кислород градиент внутри устройства микрожидком клеточной культуры. Экспериментально измеренные кислородные градиенты внутри клеточной культуральной камеры по направлению потока. Градиенты были оценены с использованием чувствительный к кислороду флуоресцентного красителя и анализа изображений. Градиенты, слева направо камеры, характеризуются, и результаты показывают профили градиента последовательные по всей ширине камеры.
Рисунок 4: Фотографии экспериментальной установки. Вся установка, включая микрофлюидальных устройства, шприцевые насосы и микроскопом живой визуализации клеток, помещается внутри обычной клеточной культуры инкубатор для оптимизацииусловия культивирования клеток во время экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Миграция клеток Результаты исследования под перпендикулярных SDF-1alpha и кислорода градиентов. (А) Изображения , снятые до и после миграции клеток исследования 12-х. Пути миграции клеток можно анализировать с захваченными времени впала изображений с помощью микроскопа живого изображения клеток. (Б) миграции клеток дорожки и проанализированный среднее движение миграции из захваченных изображений до 4 -х различных комбинаций градиент: нет градиента, только хемокин градиента, только градиента кислорода, и оба хемокинов и кислорода градиенты. Изображения были захвачены каждые 15 мин. Шкалы составляет 250 мкм, (С) Графики средних расстояний миграции клеток в перпендикулярном (градиент кислорода) и по горизонтали (хемокин градиент) направления по четырем различным комбинациям градиента. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение, полученные из трех независимых экспериментальных наборов, и 10 клеток анализировали в каждом эксперименте. Статистические существенно различаются (т-тест непарный Стьюдента, р <0,01) результаты обозначаются разными буквами (а, б). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Наиболее важные шаги для изготовления PDMS микрожидкостных устройств с тонкой пленкой Встраиваемый ПК являются: (1) изгнав все пузырьки при вставке пленки PC в PDMS форполимера в то время как фабрикации верхний ПДМС-ПК слой и (2), убедившись все PDMS отверждения процессы выполняются на хорошо выровненной горизонтальной плоскости. Для миграции клеток экспериментов, наиболее важными шагами являются: (1) устранение пузырьков внутри микрожидком устройства, трубы и шприцевые насосы во время экспериментов; (2) обеспечение того, чтобы Микрожидкостных устройство помещается на хорошо выровненной горизонтальной плоскости во время клеточного живого изображения для наблюдения миграции клеток; и (3) держа устройство увлажненной путем добавления DDH 2 O в чашке Петри в ходе экспериментов и убедившись , что вода не высохли.
Для того, чтобы успешно изготовить PDMS-PC гибридного микрожидкостных устройств без расслаивания, очень важно, чтобы удалить все пузырьки во время ПК фивставка лм. Персональный компьютер пленка может быть медленно вставляться с углом (приблизительно от 15 до 30 градусов в сторону от PDMS предварительно полимера на поверхности), чтобы предотвратить пузыри поколения во время вставки ПК пленки в PDMS предварительно полимера. В случае необходимости, вся PDMS предварительно полимера с встроенным ПК пленки может быть помещен в эксикатор, соединенного с вакуумным насосом в течение 10 мин, чтобы изгнать захваченные газовые пузырьки. Если компьютер пленка всплывает после процесса вакуумного, наконечник пипетки может быть использован, чтобы нажать пленку PC вниз на отвержденной PDMS слой. Повторите процессы вакуума и нажмите при необходимости.
Для экспериментов клеток, отсутствие пузырьков воздуха имеет решающее значение для микрожидком культуры клеток. Убедитесь, что пузырьки воздуха не будут введены в целом микрожидком установки (включая шприцевые насосы, трубы и микрожидкостных устройств) при выполнении соединений. Если пузырьки воздуха создаются в микрожидком установки за счет снижения растворимости газа при повышенной температуре EXPEriments внутри инкубатора, все экспериментальные компоненты (включая шприцы и трубки) и реагентов (в том числе и ростовую среду, пирогаллолом и NaOH) может быть помещен в инкубатор заранее (по крайней мере, 20 мин перед использованием), чтобы свести к минимуму изменения температуры , Шприцевые насосы часто вырабатывают тепло от работы двигателей в пределах насосов. Это, как правило, приемлемо для работы шприцевые насосы внутри инкубаторах; Тем не менее, не проверить температуру инкубатора во время экспериментов. Если температура возводит в ходе экспериментов, дополнительные процедуры охлаждения должны быть выполнены. может быть использовано несколько методов выполнимые охлаждения, например, размещение коробку льда в инкубатор, уменьшая количество шприцевые насосы размещены внутри инкубатора, или используя инкубатор с системой охлаждения силой.
PDMS-PC устройства Микрожидкостных культуры клеток в данной статье способна надежно генерировать перпендикулярные химические и кислородные градиенты Foг исследования миграции клеток. Ограничение разработанного устройства является то, что генерируемые профили градиента кислорода зависит от баланса между потоком кислорода, приводимого с помощью химической реакции, продувкой и диффузии кислорода из окружающей атмосферы, через устройство, и в среду. В результате, профили градиента кислорода не может быть произвольно контролируемой внутри устройства. По сравнению с существующими микрофлюидальных клеточных культур платформ, устройство разработано в данной работе является первым способен выполнять исследования клеточных культур при комбинации химических и кислорода градиентов. Все устройство может быть изготовлено с использованием обычного мягкого процесса формования литография реплики, без утомительного выравнивания и дорогой аппаратуры. Эти градиенты могут быть результаты численного моделирования и экспериментально характеризуется , чтобы обеспечить более физиологические микросреда подобные условия для исследований клеток в пробирке. При использовании пространственно ограниченных методом химической реакции с ПК пленки в качестве газа-диffusion барьер, градиент кислорода могут быть получены без использования газовых баллонов под давлением и сложные блоки управления потоком газа. Кроме того, установка требует лишь небольших количеств химических веществ (менее 10 мл в день) для поддержания градиентов кислорода. Поскольку контроль напряжения кислорода ограничивается локально вокруг микрожидкостных канала, и не нарушает окружающую концентрацию кислорода, вся установка может быть помещен внутрь обычной клеточной культуры инкубатора без дополнительной температуры, влажности, а также контрольно - измерительные приборы CO 2. В результате, разработанное устройство обладает большим потенциалом быть практически использован в биологических лабораториях.
Из-за технических ограничений, клеточные поведения при кислородном напряженности редко изучались в существующей литературе. С помощью устройства, разработанного в данной работе, культуры клеток при кислородном градиенты могут быть выполнены в простым способом, который в значительной степени способствует исследования клетки в кислородных градиентов. Furthermore, аналогичный принцип работы может быть применен для создания других физиологически соответствующие газообразные градиенты, такие как диоксид углерода и окиси азота, для ин витро клеточных культур исследования 17. Эти возможности продемонстрировать , что PDMS-PC Микрожидкостных устройство показывает большой потенциал для различных областей применения клеточных культур, в том числе тестирование на наркотики и клеточной пролиферации и миграции анализов, чтобы продвинуться в исследованиях на клеточных культурах пробирке.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302104 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Smartgene | 6011-000 | |
| 10 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302151 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Falcon 352096 | |
| 150 mm Petri dish | Dogger Science | DP-43151 | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | 78560-45-9 | |
| 3 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302118 | |
| 4'' Silicon Dummy Wafer | Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan | ||
| Acetone | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | AH3102-000000-72EC | |
| AG Double Expose Mask Aligner | M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan | AG500-4D-D-V-S-H | |
| Antibiotic-Antimyotic solution | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 15240-062 | |
| Biopsy punch | Miltex, Plainsboro, NJ | 33-31 | |
| Blunt needle | JensenGlobal, Santa Barbara, CA | Gauge 14 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | Z359629 | for cell counting |
| Buffered Oxide Etch | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | PH3101-000000-72EC | |
| Cell Culture Incubator | Caron, Marietta, OH | 6016-1 | |
| COMSOL Multiphysics | COMSOL, Burlington, MA | Ver. 4.3b | for numerical simulation of chemical gradients in the device |
| D-PBS | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 14190-144 | |
| Desicattor | A-VAC Industries, Anaheim, CA | 35.10001.01 | |
| DMEM/F12+GlutaMax-1 | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10082 | |
| Fibronectin from Human Plasma | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F2006 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMIL LED | |
| Isopropyl Alcohol (IPA) | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | CMOS112-00000-72EC | |
| JuLi Smart Fluorescence Cell Imager | NanoEnTek, Seoul, Korea | DBJ01B | |
| Mechanical Convention Oven | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Lindberg Blue M MO1450C | |
| NaOH | Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan | 1943-0150 | |
| Plasma tretment system | Nordson MARCH, Concord CA | PX-250 | for oxygen plasma surface treatment |
| Polycarbonate (PC) film | Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan | ||
| Polydimehtylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI | SYLGARD 184 | |
| Pyrogallol | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | A13405 | |
| Removable Adhesive Putty | 3M | 860 | |
| Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | ||
| Spin Coater | ELS Technology, Hsinchu, Taiwan | ELS 306MA | |
| SU-8 2050 | MicroChem, Westborough, MA | SU-8 2050 | |
| SU-8 Developer | MicroChem, Westborough, MA | Y020100 | |
| Surgical blade | Feather, Osaka, Japan | 5005093 | for PDMS cutting |
| Syringe Pump | Chemyx, Houston, TX | Fusion 400 | |
| T75 Cell Culture Flask | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Nunc 156367 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 25200 | |
| Tygon PTFE Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | ||
| Tygon Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | 621 |
References
- Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J.
- Wang, F. The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).
- Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).
- Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).
- Chung, B. G., et al. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).
- Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
- Allen, J. W., Bhatia, S. N. Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).
- McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).
- Chang, C. W., et al. A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).
- Chen, Y. A., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).
- Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Cordelières, F. P. Manual Tracking. , Institute Curie. Orsay, France. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2005).
- Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf (2013).
- Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104 (2013).
