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Bioengineering

सेल प्रवासन अध्ययन के तहत सीधा केमिकल और आक्सीजन gradients के लिए Polydimethylsiloxane-पॉली कार्बोनेट microfluidic उपकरणों

Published: February 23, 2017 doi: 10.3791/55292
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

Abstract

यह पत्र एक microfluidic एक एम्बेडेड पॉली कार्बोनेट (पीसी) रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के संयोजन के तहत सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए पतली फिल्म के साथ polydimethylsiloxane (PDMS) से बने उपकरण रिपोर्ट। दोनों रासायनिक और ऑक्सीजन ढ़ाल बहुत विवो में सेल प्रवास को प्रभावित कर सकते हैं; हालांकि, तकनीकी सीमाओं के कारण, बहुत कम शोध इन विट्रो में उनके प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया है। डिवाइस इस अनुसंधान के क्षेत्र में विकसित टेढ़ा के आकार चैनलों वांछित रासायनिक ढ़ाल उत्पन्न करने के लिए की एक श्रृंखला का लाभ लेता है और ऑक्सीजन ढाल पीढ़ी के लिए एक स्थानिक सीमित रासायनिक प्रतिक्रिया विधि का लाभ उठाते। रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के निर्देशों एक दूसरे से सीधा सीधा प्रवास परिणाम व्याख्या सक्षम करने के लिए कर रहे हैं। ताकि कुशलता से कम से कम रासायनिक खपत के साथ ऑक्सीजन ढ़ाल उत्पन्न करने के लिए, एम्बेडेड पीसी पतली फिल्म एक गैस प्रसार बाधा के रूप में उपयोग किया जाता है। विकसित microfluidic युक्तिसिरिंज पंप से प्रेरित और सेल प्रवास प्रयोगों के दौरान एक पारंपरिक सेल इनक्यूबेटर में रखा सेटअप सरलीकरण और अनुकूलित सेल संस्कृति शर्तों के लिए अनुमति देने के लिए किया जा सकता है। सेल प्रयोगों में, हम, adenocarcinomic मानव वायुकोशीय बेसल उपकला कोशिकाओं, A549 के माइग्रेशन का अध्ययन करने के केमोकाइन के संयोजन के तहत (stromal सेल व्युत्पन्न कारक, एसडीएफ 1α) और ऑक्सीजन ढ़ाल डिवाइस का इस्तेमाल किया। प्रयोगात्मक परिणाम बताते हैं कि डिवाइस स्थिरतापूर्वक सीधा केमोकाइन और ऑक्सीजन ढ़ाल पैदा करते हैं और कोशिकाओं के साथ संगत है सकते हैं। प्रवास का अध्ययन परिणामों से संकेत मिलता है कि ऑक्सीजन ढ़ाल के तहत ढ़ाल के संयोजन एकल ढ़ाल के तहत उन लोगों से की भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है सेल प्रवास का मार्गदर्शन में एक आवश्यक भूमिका, और सेलुलर व्यवहार निभा सकते हैं। डिवाइस सेल संस्कृति में रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए एक शक्तिशाली और व्यावहारिक उपकरण है, जो अधिक विवो तरह microenvi में बेहतर सेल प्रवास के अध्ययन को बढ़ावा देने के कर सकते हैं प्रदान करता हैronments।

Introduction

घुलनशील कारकों और ऑक्सीजन तनाव के स्थानिक वितरण विवो 1, 2, 3, 4 में महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों की एक संख्या को नियंत्रित कर सकते। ताकि बेहतर कोशिकाओं पर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए, इन विट्रो सेल संस्कृति मंच स्थिरतापूर्वक रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल पैदा करने में सक्षम अत्यधिक वांछित है। विभिन्न घुलनशील कारकों जैविक गतिविधियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सेलुलर व्यवहार प्रभावित करते हैं। हाल ही में, microfluidic तकनीक की उन्नति के कारण, microfluidic स्थिरतापूर्वक पैदा रासायनिक ढ़ाल के लिए सक्षम उपकरणों की एक संख्या सेल प्रवास 5 अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। इसके अलावा, कई अध्ययनों से यह भी इन विट्रो सेल संस्कृतियों 6, 7, 8 के लिए ऑक्सीजन तनाव की आवश्यकता पता चला है। तथापि,सेल संस्कृति के लिए ऑक्सीजन तनाव के नियंत्रण मुख्य रूप से दबाव गैस सिलेंडरों के साथ ऑक्सीजन सफाई या सेल इन्क्यूबेटरों के लिए प्रत्यक्ष रासायनिक इसके अलावा इस पर निर्भर करता है। प्रत्यक्ष रासायनिक इसके अलावा सेल संस्कृति के माध्यम से बदल और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है। ऑक्सीजन नियंत्रण इन्क्यूबेटरों विशेष इनक्यूबेटर डिजाइन, सटीक गैस प्रवाह नियंत्रण, और आदेश हाइपोक्सिया की स्थिति को प्राप्त करने में नाइट्रोजन गैस की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह इस सेटअप है, जो विभिन्न ऑक्सीजन तनाव और ढ़ाल के तहत सेलुलर व्यवहार का अध्ययन अवरूद्ध का उपयोग कर ऑक्सीजन के स्थानिक वितरण को नियंत्रित करने के अव्यवहार्य है। इन सीमाओं को पार करने के लिए, microfluidic उपकरणों की एक संख्या सेल संस्कृति अनुप्रयोगों 9 के लिए ऑक्सीजन ढ़ाल उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, उनमें से ज्यादातर दबाव गैसों, जो वाष्पीकरण और बुलबुला पीढ़ी समस्याओं का कारण बन सकता है का उपयोग कर संचालित कर रहे हैं। इसलिए, वे अक्सर परिष्कृत उपकरण की आवश्यकता होती है और लंबे समय तक सेल संस्कृति अध्ययन के लिए विश्वसनीय नहीं हो सकताएस।

चुनौतियों पर काबू पाने के लिए और आगे सेल प्रवास के लिए रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, हम एक microfluidic सेल संस्कृति एक एम्बेडेड पॉली कार्बोनेट (पीसी) पतली फिल्म 10 के साथ polydimethylsiloxane (PDMS) के बने डिवाइस विकसित की है। डिवाइस दो microfluidic चैनल परतें एक PDMS झिल्ली द्वारा अलग से बना है। ऊपर परत ऑक्सीजन ढाल पीढ़ी के लिए एक PDMS-पीसी परत है; नीचे की परत रासायनिक ढाल पीढ़ी और सेल संस्कृति के लिए PDMS से बना है। डिवाइस एक साथ गैस सिलेंडरों और परिष्कृत प्रवाह नियंत्रण प्रणाली का उपयोग किए बिना सीधा रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल उत्पन्न कर सकते हैं। डिवाइस में, PDMS महान ऑप्टिकल पारदर्शिता, गैस पारगम्यता, और सेल संस्कृति और इमेजिंग के लिए जैविक अनुकूलता प्रदान करता है। एम्बेडेड पीसी फिल्म कुशल ऑक्सीजन तनाव नियंत्रण के लिए एक गैस प्रसार बाधा के रूप में कार्य करता है। microfluidic चैनल में, हम टेढ़ा के आकार का चैनल की एक श्रृंखला के लिए इस्तेमाल कियारासायनिक ढ़ाल उत्पन्न करते हैं। डिजाइन मोटे तौर पर अपनी विश्वसनीयता और आसान प्रयोगात्मक स्थापना के कारण विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए microfluidic उपकरणों में रासायनिक ढ़ाल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, रासायनिक ढाल प्रोफाइल संख्यात्मक सिमुलेशन के साथ पहले से चैनल geometries अलग से बनाया जा सकता है। ऑक्सीजन ढाल पीढ़ी के लिए, हम स्थानिक सीमित रासायनिक प्रतिक्रिया तरीका है कि पहले से हमारी प्रयोगशाला में 10, 11, 12 में विकसित किया गया था का फायदा उठाया। ऑक्सीजन नाइट्रोजन मिटाने के बिना निर्दिष्ट क्षेत्रों द्वारा खा जा सकता है। जैविक प्रयोगशालाओं में व्यावहारिक उपयोग के लिए, पूरे प्रयोगात्मक स्थापना पारंपरिक सेल संस्कृति इन्क्यूबेटरों के साथ संगत है। इन तरीकों को एकीकृत करके, हम एक साथ सेल प्रवास का अध्ययन करने के क्रम में थोक गैस सिलेंडर और परिष्कृत उपकरण के बिना स्थिर रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल उत्पन्न कर सकते हैं।

Protocol

1. microfluidic डिवाइस के निर्माण

ध्यान दें: पूरे microfluidic युक्ति नरम लिथोग्राफी प्रतिकृति मोल्डिंग प्रक्रिया 13 का उपयोग कर निर्मित है।

  1. Microfluidic युक्ति में PDMS परतों के लिए नए नए साँचे का निर्माण
    1. डिजाइन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उदाहरण का उपयोग कर या सॉफ्टवेयर ड्राइंग microfluidic चैनल पैटर्न। उच्च संकल्प पारदर्शिता photomask मुद्रण 14 के लिए एक कंपनी के लिए फाइल जमा करें।
    2. एसीटोन (≥99.5%), isopropyl शराब के साथ स्वच्छ सिलिकॉन वेफर्स (आईपीए; ≥99.9%), और बफर ऑक्साइड खोदना (बीओई; 6: 1 एनएच 4 F.HF)। विआयनीकृत (डीआई) पानी से कुल्ला और एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ वेफर निर्जलीकरण।
    3. नकारात्मक स्वर photoresist की स्पिन कोट लगभग 20 ग्राम, SU-8 2050, 15 सेकंड के लिए 500 rpm पर वेफर्स पर और उसके बाद 2,000 30 सेकंड के लिए आरपीएम।
      नोट: स्पिन कोटिंग हालत SU-8 2050 तस्वीर उपज चाहिएऑप्टिकल लिथोग्राफी के बाद लगभग 75 माइक्रोन वेफर्स पर की मोटाई के साथ परतों का विरोध।
    4. शीतल सेंकना 3 मिनट के लिए और फिर 9 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक 65 डिग्री सेल्सियस hotplate पर वेफर्स। मुलायम सेंकना करने के बाद, पराबैंगनी प्रकाश के तहत बनाया गया पारदर्शिता मास्क के साथ एक मुखौटा aligner का उपयोग कर वेफर्स बेनकाब; कुल निवेश ऊर्जा के बारे में 300 MJ / 2 सेमी होना चाहिए। बाद जोखिम सेंकना (PEB) 2 मिनट के लिए और फिर 7 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 65 डिग्री सेल्सियस पर वेफर्स।
    5. PEB के बाद, मजबूत आंदोलन के साथ या एक अल्ट्रासोनिक स्नान 7 मिनट के लिए (37 kHz और 180 W प्रभावी अल्ट्रासोनिक शक्ति) में SU-8 डेवलपर में वेफर्स विसर्जित कर दिया। एसीटोन और आईपीए के साथ वेफर कुल्ला अवशिष्ट SU-8 हटा दें।
    6. वेफर और silane के 100 μl प्लेस (1H, 1h, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) के क्रम में अवांछित संबंधों को रोकने के लिए वेफर सतह silanization के लिए एक डायाफ्राम वैक्यूम पंप के साथ जुड़े हुए Desiccator में एक 6 सेमी व्यास पेट्री डिश में। 15 मिनट के लिए पंप पर बारी, इसे बंदऔर 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम के साथ desiccator सील।
    7. desiccator से बाहर silanized वेफर्स ले लो और नरम लिथोग्राफी प्रक्रिया का पालन करने के लिए 15 सेमी व्यास पेट्री डिश के लिए उन्हें टेप:
  2. निर्माण और PDMS परतों के विधानसभा
    1. पूर्व बहुलक PDMS की तैयारी
      1. एक 10 पर PDMS मोनोमर (आधार) और इलाज एजेंट मिक्स: 1 अनुपात (वी / वी)। 60 मिनट के लिए desiccator सेटअप में मिश्रण देगास।
    2. पीसी-एम्बेडेड ऊपर परत का निर्माण
      1. स्थानांतरण 2 पूर्व बहुलक PDMS शीर्ष परत fluidic चैनल पैटर्न के साथ मोल्ड पर ग्राम PDMS की एक पतली परत बनाने के लिए। 60 मिनट के लिए PDMS देगास के लिए desiccator सेटअप में ढालना रखें।
      2. PDMS इलाज के लिए एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में ढालना रात भर रखें। सुनिश्चित करें कि मोल्ड एक क्षैतिज विमान पर है।
      3. कमरे के तापमान को ढालना शांत हो जाओ। मोल्ड पर PDMS पूर्व बहुलक का एक अतिरिक्त 13 जी डालो और वीं में PDMS देगास60 मिनट के लिए ई desiccator सेटअप।
      4. धीरे-धीरे एक गैस प्रसार बाधा के रूप में ताजा PDMS परत में एक 1 मिमी मोटी पीसी फिल्म एम्बेड; यदि आवश्यक हो तो किसी भी बुलबुले निष्कासित।
      5. 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में ढालना रात भर रखो, और यकीन है कि यह एक क्षैतिज प्लेन पर है।
      6. कमरे के तापमान को ठीक PDMS शांत हो जाओ। लगभग 5.5 एक्स 5 सेमी 2 के एक क्षेत्र है, जो सभी चैनल पैटर्न को कवर कर सकते करने के लिए एक छुरी के साथ डिवाइस में कटौती, और ढालना से PDMS स्लैब दूर छील।
      7. inlets और दुकानों एक 2 मिमी व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग के लिए छेद पंच। गढ़े शीर्ष PDMS-पीसी परत बाद में विधानसभा के लिए परिवेश धूल से दूर स्टोर।
    3. नीचे PDMS परत का निर्माण
      1. नीचे की परत के लिए मोल्ड पर PDMS पूर्व बहुलक की 11 ग्राम डालो। 60 मिनट के लिए PDMS देगास के लिए desiccator में ढालना रखें। PDMS इलाज करने के लिए एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में ढालना रात भर रखें। यकीन है कि यह एक क्षैतिज विमान पर झूठ बोल रही है।
      2. नीचे वें कूलकमरे के तापमान को ई PDMS। लगभग 5.5 एक्स 5 सेमी 2 के एक क्षेत्र है, जो सभी चैनल पैटर्न कवर कर सकते हैं, और मोल्ड के बंद इसे छील करने के लिए डिवाइस कट। गढ़े नीचे PDMS परत बाद में विधानसभा के लिए परिवेश धूल से दूर स्टोर।
    4. PDMS झिल्ली का निर्माण
      1. स्पिन कोट लगभग 4 90 सेकंड के लिए 100 rpm पर एक silanized खाली वेफर पर PDMS पूर्व बहुलक जी और फिर 4 सेकंड के लिए 3000 rpm। ओवन रात भर एक 60 डिग्री सेल्सियस में स्पिन में लिपटे वेफर सेंकना।
    5. डिवाइस के विधानसभा
      1. गढ़े PDMS-पीसी ऊपर परत और संबंध सतहों का सामना करना पड़ के साथ एक हे 2 प्लाज्मा सतह के उपचार मशीन में स्पिन में लिपटे PDMS झिल्ली के साथ वेफर रखें। 40 सेकंड के लिए हे 2 प्लाज्मा के डब्ल्यू समझो 90 के साथ PDMS सतहों।
      2. सही हे 2 प्लाज्मा सतह के उपचार के बाद शीर्ष स्तर PDMS झिल्ली पर बांड। बंधुआ परतों के शीर्ष पर एक वजन (लगभग 600 ग्राम) रखें और उन्हें एक में डाल60 डिग्री सेल्सियस ओवन संबंध को बढ़ावा देने के लिए रात भर।
      3. कमरे के तापमान को बंधुआ परतों शांत हो जाओ और लगभग 5.5 एक्स 5 सेमी 2 के एक क्षेत्र है, जो सभी चैनल पैटर्न को कवर कर सकते हैं झिल्ली एक छुरी के साथ शीर्ष परत को बंधुआ काटा। सिलिकॉन वेफर से बंधुआ संरचना छील और inlets और एक 2 मिमी व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग रासायनिक ढाल चैनल की दुकान पर छेद मुक्का।
      4. झिल्ली बंधुआ ऊपर परत और गढ़े PDMS नीचे की परत हे 2 प्लाज्मा सतह के उपचार मशीन में रखें, संबंध सतहों का सामना करना पड़ के साथ, 40 सेकंड के लिए 90 डब्ल्यू पर PDMS प्लाज्मा का उपयोग सतहों को सक्रिय करें।
      5. ऊपर और नीचे परतों सतह के उपचार के बाद तुरंत संबंधों के लिए एक साथ संलग्न। पूरे बंधुआ डिवाइस के शीर्ष पर एक वजन (लगभग 600 ग्राम) प्लेस और एक 60 डिग्री सेल्सियस में यह ओवन में रात भर रखा।
      6. पूरे गढ़े डिवाइस ओवन से बाहर ले लो और कमरे के तापमान पर इसे शांत।

2. Microfluidic सेल प्रवास परख

नोट: इस पत्र में, हम आमतौर पर इस्तेमाल किया सेल लाइन, adenocarcinomic मानव वायुकोशीय बेसल उपकला सेल (A549), और एक केमोकाइन, stromal सेल व्युत्पन्न कारक (एसडीएफ 1α), उदाहरण के रूप में इस्तेमाल करते हैं। अन्य कोशिकाओं और chemokines पर काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के अनुसार समायोजित करें।

  1. 0 दिवस: सेल तैयारी
    1. संस्कृति पूरा मध्यम विकास में A549 कोशिकाओं DMEM F12 एल glutamine विकल्प नहीं है, 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 1% (वी / वी) antimicrob-कवकनाशी समाधान युक्त का जायजा। उप-संस्कृति 0.25% trypsin EDTA के साथ हदबंदी से।
    2. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 140 XG पर अलग कोशिकाओं centrifuging द्वारा प्रयोगों के लिए सेल निलंबन तैयार करें। Microfluidic युक्ति प्रयोगों के लिए, एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती और पूरा का 10 मिलीलीटर के साथ एक T75 फ्लास्क में कम से कम 1 x 10 6 कोशिकाओं बीजतरक्की का जरिया।
      नोट: सभी सेल संस्कृति प्रक्रियाओं एक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ एक मशीन में प्रदर्शन कर रहे हैं।
  2. दिन 1: डिवाइस तैयारी
    1. डिवाइस हे 2 प्लाज्मा मशीन में डाल दिया है और इसे प्रस्तुत करने के लिए microfluidic चैनल हाइड्रोफिलिक सतहों 40 सेकंड के लिए 90 डब्ल्यू पर हे 2 प्लाज्मा के साथ व्यवहार करते हैं।
    2. तुरंत सतह उपचार के बाद सीधे 2 मिमी व्यास रासायनिक ढाल चैनल inlets पर PDMS परत में छेद छिद्रित में सुई डालने से दो 14 जी कुंद सुइयों स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि सुई microfluidic चैनलों को ब्लॉक नहीं करते हैं। एक कुंद 14 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग DDH 2 हे के 0.8 मिलीलीटर ड्रा। जब तक पानी inlets पर दोनों सुइयों से बाहर बहती DDH 2 हे आउटलेट से रासायनिक ढाल चैनल में इंजेक्षन।
    3. Dulbecco & # साथ फ़ाइब्रोनेक्टिन शेयर गिराए द्वारा 50 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin समाधान के 1 मिलीलीटर की तैयारी39 की फॉस्फेट बफर खारा (DPBS)।
    4. एक कुंद 14 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग रासायनिक ढाल चैनल के आउटलेट से fibronectin समाधान दिखे जब तक समाधान inlets पर दोनों सुइयों से बाहर बहती है।
    5. एक पारंपरिक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में पूरे डिवाइस रातोंरात सेते हैं।
  3. दिन 2: सेल बोने और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
    1. सेल बोने
      1. कोशिकाओं है कि 0 दिन के बाद से सुसंस्कृत थे से मध्यम Aspirate और साथ DPBS के 5 मिलीलीटर में 2 बार कोशिकाओं को धो लें। DPBS Aspirate, trypsin-EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और कुप्पी सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
      2. रुको जब तक कोशिकाओं को अलग किया और समाधान में निलंबित कर रहे हैं और सीरम मुक्त माध्यम के 8 मिलीलीटर जोड़ने (DMEM F12 + 1% (वी / वी) antimicrob-कवकनाशी समाधान) फ्लास्क। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में तरल के सभी स्थानांतरण और कमरे के तापमान के तहत 5 मिनट के लिए 140 XG पर यह अपकेंद्रित्र। Centrifuging के बाद सतह पर तैरनेवाला Aspirate और अंतिम सेल घनत्व 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल बनाने के लिए सीरम मुक्त माध्यम का एक उचित मात्रा में जोड़ें। 1 दिवस के पर तैयार microfluidic युक्ति बाहर ले जाओ एक hemocytometer या किसी अन्य के लिए स्वत: सेल गिनती साधन का उपयोग कोशिकाओं की गणना करें।
      3. एक कुंद 14 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग रासायनिक ढाल चैनल के आउटलेट से सीरम मुक्त मध्यम इंजेक्षन जब तक मध्यम inlets पर दोनों सुइयों से बाहर बहती है। रासायनिक ढाल चैनल के आउटलेट से सेल निलंबन के 200 μl इंजेक्षन।
      4. एक खुर्दबीन के नीचे डिवाइस में सेल संस्कृति कक्ष का निरीक्षण पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाओं microfluidic चैनल के लिए पेश किया गया है। इस उपकरण में एक नम कंटेनर (जैसे, DDH 2 हे के अंदर के साथ एक प्लास्टिक का डिब्बा) में रखें और डिवाइस सतह पर कोशिकाओं के आसंजन को बढ़ावा देने के लिए 5 घंटे के लिए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में इसे रख लो।
    2. REAG की तैयारीरासायनिक ढाल पीढ़ी के लिए दस्तावेजों
      1. सीरम मुक्त माध्यम में वांछित एकाग्रता (100 एनजी / एमएल) में रासायनिक (एसडीएफ 1α) तैयार करें। साथ और उच्च शुद्धता ट्यूबिंग से जुड़े दो अलग-अलग 3 मिलीलीटर सीरिंज में रासायनिक बिना सीरम मुक्त मध्यम ड्रा। बाद में उपयोग के लिए 1 μl / मिनट की एक प्रवाह की दर के साथ एक सिरिंज पंप पर सीरिंज सेट करें।
    3. ऑक्सीजन ढाल पीढ़ी के लिए अभिकर्मकों की तैयारी
      1. 1 एम NaOH समाधान के 15 मिलीग्राम और 200 मिलीग्राम / एमएल pyrogallol समाधान के 15 मिलीलीटर बनाओ। उच्च शुद्धता PTFE ट्यूबिंग और उच्च शुद्धता ट्यूबिंग, क्रमशः से जुड़े दो अलग-अलग 15 मिलीलीटर सीरिंज में NaOH और pyrogallol समाधान ड्रा। बाद में उपयोग के लिए 5 μl / मिनट के प्रवाह की दर के साथ एक सिरिंज पंप पर सीरिंज सेट करें।
    4. Microfluidic डिवाइस सेटअप
      1. 5 घंटा ऊष्मायन के बाद, पूरे डिवाइस बाहर ले और एक 15 सेमी व्यास पेट्री डिश पर जगह है। चिपकने वाला जोड़ने का मसाला का उपयोग कर पेट्री डिश में डिवाइस को ठीक करें। स्थानांतरणएक मशीन में एक लाइव सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप के लिए पेट्री डिश।
      2. रासायनिक ढाल चैनल के inlets के लिए रासायनिक ढाल पीढ़ी के लिए सीरिंज से ट्यूबिंग कनेक्ट करें। बर्बादी जलाशय के लिए अग्रणी टयूबिंग के लिए आउटलेट से कनेक्ट करें। रासायनिक ढाल पीढ़ी के लिए सीरिंज के साथ सिरिंज पंप पर बारी।
      3. ऑक्सीजन ढाल चैनल के inlets को NaOH और pyrogallol युक्त सीरिंज से उच्च शुद्धता ट्यूबिंग कनेक्ट करें। कचरे को इकट्ठा करने के आउटलेट के लिए ट्यूबिंग कनेक्ट करें। ऑक्सीजन ढाल पीढ़ी के लिए सीरिंज के साथ सिरिंज पंप पर बारी।
      4. पेट्री डिश के लिए DDH 2 हे के बारे में 15 मिलीलीटर जोड़ें डिवाइस moisturized रखने के लिए। समय व्यपगत छवि पर कब्जा करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप सेट अप, और एक छवि हर 15 मिनट लेते हैं।
  4. दिन 3: डेटा संग्रह और विश्लेषण
    1. एक कंप्यूटर से कब्जा कर लिया छवि फ़ाइलों को हस्तांतरण। एक खुला स्रोत छवि एक का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण करेंalysis सॉफ्टवेयर, ImageJ, मैनुअल ट्रैकिंग के लिए एक खुला स्रोत प्लगइन (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) और एक मुक्त chemotaxis उपकरण सॉफ्टवेयर के साथ (http://ibidi.com/xtproducts / hi / सॉफ्टवेयर और छवि विश्लेषण / मैनुअल छवि विश्लेषण / chemotaxis और प्रवासन-उपकरण) 15, 16।

3. ढ़ाल की विशेषता

ध्यान दें: रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल से पहले या सेल प्रयोगों के बाद होती जा सकता है।

  1. रासायनिक ढाल के संख्यात्मक सिमुलेशन
    1. कम्प्यूटेशनल fluidic गतिशीलता (सीएफडी) सिमुलेशन का उपयोग microfluidics की लामिना का प्रवाह प्रकृति का अनुमान है।
  2. ऑक्सीजन ढाल की प्रायोगिक लक्षण वर्णन
    1. 5 की एकाग्रता में एक ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक, Tris (2,2'-bipyridyl) दयाता (तृतीय) क्लोराइड hexahydrate, पानी में घोल तैयार करेंमिग्रा / मिली।
    2. उच्च शुद्धता ट्यूबिंग से जुड़े दो अलग-अलग 3 मिलीलीटर सीरिंज में ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील डाई समाधान ड्रा। 1 μl / मिनट (प्रवाह रासायनिक ढाल पीढ़ी के लिए इस्तेमाल दरों के समान) के प्रवाह की दर के साथ एक सिरिंज पंप पर सीरिंज सेट करें।
    3. रासायनिक ढाल चैनल के inlets के लिए सीरिंज से ट्यूबिंग कनेक्ट करें। बर्बादी जलाशय के लिए अग्रणी टयूबिंग के लिए आउटलेट से कनेक्ट करें। रासायनिक ढाल पीढ़ी के लिए सीरिंज के साथ सिरिंज पंप पर बारी।
    4. उपाय प्रतिदीप्ति तीव्रता उत्तेजना प्रकाश एक 470 ± 20 एनएम ऑप्टिकल फिल्टर के माध्यम से गुजर रहा है के साथ एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग। एक 515 एनएम लंबे पास उत्सर्जन एक शांत सीसीडी कैमरे का उपयोग फिल्टर के माध्यम से उत्सर्जन प्रकाश लीजिए।
    5. ऑक्सीजन ढाल चैनल के inlets को NaOH और pyrogallol युक्त सीरिंज से उच्च शुद्धता ट्यूबिंग कनेक्ट करें। कचरे को इकट्ठा करने के आउटलेट के लिए ट्यूबिंग कनेक्ट करें। ऑक्सीजन के लिए सीरिंज के साथ सिरिंज पंप पर बारीढाल पीढ़ी।
    6. ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील डाई सेल संस्कृति कक्ष में बहने की प्रतिदीप्ति छवियों को ले लीजिए।
    7. ऑक्सीजन ढाल पीढ़ी के लिए प्रवाह बंद करो और ऑक्सीजन पीढ़ी चैनल के लिए सभी ट्यूबिंग काट। ऑक्सीजन ढाल चैनल के आउटलेट के लिए गैस सिलेंडरों से उच्च शुद्धता ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
    8. ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील डाई सेल संस्कृति कक्ष में बह जब ऑक्सीजन ढाल चैनल से जुड़े ट्यूबिंग में हवा, शुद्ध नाइट्रोजन, ऑक्सीजन और शुद्ध बहने की प्रतिदीप्ति छवियों को ले लीजिए।
    9. संदर्भ 10 और 11 के अनुसार स्टर्न Volmer समीकरण का उपयोग प्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण करके ऑक्सीजन ढ़ाल का अनुमान है।

Representative Results

गढ़े PDMS-पीसी संकर microfluidic सेल संस्कृति डिवाइस। अंजीर। 1 एक तस्वीर और microfluidic युक्ति का एक उदाहरण से पता चलता है। नीचे की परत छह अलग मिश्रण अनुपात के साथ दो अलग inlets से शुरू की अभिकर्मकों से समाधान उत्पन्न करने के लिए टेढ़ा के आकार चैनलों के चार स्तर होते हैं। (बाएं: दाएं) 1: inlets से शुरू की दो समाधान के बीच 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3: 1, 4, और 0 से सैद्धांतिक रूप से, छह अलग-अलग अनुपात में मिश्रण कर रहे हैं 1। रासायनिक ढ़ाल छह अलग-मिश्रण अनुपात समाधान द्वारा निर्माण सेल संस्कृति कक्ष में उत्पन्न किया जा सकता, नीचे की ओर स्थित है। ऊपर और नीचे परतों एक PDMS झिल्ली से अलग होती है। ऊपर परत में, ऑक्सीजन सफाई रासायनिक प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्मकों दो अलग inlets से microfluidic चैनल में पेश कर रहे हैं। अभिकर्मकों तुरंत करने के लिए सेल संस्कृति कक्ष के शीर्ष पर बहने से पहले प्रतिक्रिया के लिए एक दूसरे के साथ मिश्रित कर रहे हैंनीचे चैनल से ऑक्सीजन, प्रत्यक्ष रासायनिक संपर्क के बिना मांजना। एम्बेडेड पीसी फिल्म, एक छोटे गैस प्रसार गुणांक के साथ PDMS की तुलना में, एक प्रसार बाधा है कि ऑक्सीजन सफाई अधिक कुशल बनाता है के रूप में कार्य करता है। ऑक्सीजन धीरे-धीरे प्रवाह दिशा के साथ एक ऑक्सीजन ढाल के रूप में करने के लिए नीचे की ओर क्षेत्र में PDMS के माध्यम से वापस सेल संस्कृति चैम्बर के लिए diffuses। चूंकि ऑक्सीजन सफाई रासायनिक प्रतिक्रिया स्थानिक ही सीमित है, केवल स्थानीय ऑक्सीजन तनाव प्रभावित कर रहे हैं। नतीजतन, डिवाइस अपने वैश्विक ऑक्सीजन तनाव बदलने के बिना एक पारंपरिक सेल इनक्यूबेटर में उपयोग किया जा सकता है। पलायन प्रयोगों में, कोशिकाओं के अवलोकन के लिए सेल संस्कृति कक्ष के अंदर वरीयता प्राप्त हैं। मध्यम विकास और रासायनिक अभिकर्मकों ठीक नियंत्रित प्रवाह की दर के साथ सिरिंज पंप का उपयोग कर डिवाइस के लिए पेश कर रहे हैं।

रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल की विशेषता उपकरण के अंदर उत्पन्न। टी कारणवह microfluidics की प्रकृति प्रवाह लामिना, प्रवाह व्यवहार कम्प्यूटेशनल fluidic गतिशीलता (सीएफडी) सिमुलेशन का उपयोग भविष्यवाणी की जा सकती है। इस पत्र में, हम एक 3 डी मॉडल का निर्माण और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Multiphysics मॉडलिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अनुकरण प्रदर्शन किया। अंजीर। 2 (क) सेल संस्कृति प्रतिदीप्ति तीव्रता माप और संख्यात्मक सिमुलेशन परिणाम के आधार पर चैम्बर की चौड़ाई में प्रयोगात्मक विशेषता fluorescein एकाग्रता प्रोफाइल के बीच तुलना से पता चलता है। प्रयोगात्मक और सिमुलेशन परिणाम के बीच समझौते पता चलता है कि सीएफडी मॉडल अच्छी तरह से डिवाइस के अंदर उत्पन्न रासायनिक ढ़ाल अनुमान कर सकते हैं। अंजीर। 2 (ख) नकली एसडीएफ 1α सेल संस्कृति कक्ष में उत्पन्न ढाल भूखंडों। अंजीर। 3 सेल प्रयोगों से पहले सेल संस्कृति कक्ष के अंदर ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील प्रतिदीप्ति डाई बहने से ऑक्सीजन ढाल लक्षण वर्णन परिणाम दिखाता है। परिणाम इंगित करता है कि एक ऑक्सीजन gradiईएनटी, के बारे में 1 से 16% से लेकर, ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है।

सेल प्रवास का परिणाम है। एक प्रदर्शन के रूप में, हम केमोकाइन के 4 संयोजन (एसडीएफ 1α) और ऑक्सीजन ढ़ाल के तहत A549 सेल प्रवास अध्ययन प्रदर्शन किया: (1) कोई केमोकाइन और एक नियंत्रण के रूप में कोई ऑक्सीजन ढ़ाल, (2) एक केमोकाइन ढाल के साथ और एक ऑक्सीजन ढाल के बिना, (3) एक ऑक्सीजन ढाल के साथ और एक केमोकाइन ढाल के बिना, और (4) दोनों केमोकाइन और ऑक्सीजन ढ़ाल के साथ। अंजीर। 4 पूरे प्रयोगात्मक स्थापना की तस्वीर से पता चलता है। प्रयोगों सभी पूरे सेटअप यह अंदर रखा (microfluidic उपकरणों, सिरिंज पंप, और लाइव सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप सहित) के साथ एक पारंपरिक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में प्रदर्शन किया गया। सेल प्रवास परिणाम छवि में दिखाया जाता है। 5। अंजीर। 5 (क) लाइव सेल इमेजिंग एना का उपयोग करते हुए प्रयोगों के दौरान एकत्र की छवियों से पता चलताLyzer, और अंजीर। 5 (ख) और (ग) plugins के साथ ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण चार संयोजनों के तहत सेल प्रवास trajectories और औसत आंदोलनों भूखंडों। परिणाम है कि नियंत्रण में औसत सेल प्रवास दूरी शून्य दृष्टिकोण है, जो प्रयोग में कोशिकाओं के यादृच्छिक आंदोलन का सुझाव दिखा। इसके विपरीत, केवल केमोकाइन ढाल के साथ, कोशिकाओं की औसत आंदोलन छोड़ दिया, जहां एसडीएफ 1α एकाग्रता अधिक है की ओर है। परिणाम A549 कोशिकाओं है, जो पहले से सूचित कर दिया गया है की एसडीएफ 1α chemotaxis व्यवहार सुझाव देते हैं। केवल ऑक्सीजन ढ़ाल के साथ प्रयोग में, कोशिकाओं की औसत आंदोलन ऊपर की तरफ, जहां ऑक्सीजन तनाव कम है। ज्यादा दिलचस्प है, सीधा केमोकाइन और ऑक्सीजन ढ़ाल के साथ प्रयोग में, कोशिकाओं की औसत आंदोलन ऊपर और क्षैतिज दिशा में कोई स्पष्ट आंदोलन (केमोकाइन ढाल दिशा) के बिना है।


चित्रा 1: गढ़े PDMS-पीसी microfluidic सेल संस्कृति डिवाइस। (क) मज़बूती से सेल प्रवास के अध्ययन के लिए सीधा रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल पैदा करने में सक्षम गढ़े डिवाइस की प्रयोगात्मक तस्वीर। रासायनिक ढाल चैनल सेल संस्कृति कक्ष के अंदर ढाल पीढ़ी प्रदर्शित करने के लिए नीले और पीले खाना रंगों से भर जाता है। ऑक्सीजन ढाल चैनल लाल खाद्य रंग से भर जाता है। पैमाने बार 1 सेमी है। (ख) microfluidic युक्ति के योजनाबद्ध। ऊपर परत सेल संस्कृति कक्ष के अंदर कुशल ऑक्सीजन ढाल नियंत्रण के लिए एक गैस प्रसार बाधा के रूप में एक एम्बेडेड पीसी परत के साथ PDMS का उपयोग कर निर्मित है। (ग) ऊपर और नीचे परतों के निर्माण के लिए मास्टर नए नए साँचे। करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र 2
चित्रा 2: microfluidic सेल संस्कृति डिवाइस के अंदर रासायनिक ढाल। (क) संख्यानुसार नकली और प्रयोगात्मक सेल संस्कृति कक्ष (Y दिशा) की चौड़ाई में सेल संस्कृति कक्ष के अंदर fluorescein एकाग्रता ढाल होती है। नकली और प्रयोगात्मक मापा ढ़ाल के बीच समानता इंगित करता है कि अच्छी तरह से अनुकरण रासायनिक ढाल भविष्यवाणी कर सकते हैं। चित्रा इनसेट तीन आयामी (3 डी) मॉडल के अनुकरण के लिए निर्माण से पता चलता है। (ख) सेल प्रवास के अध्ययन के लिए सेल संस्कृति कक्ष की चौड़ाई में एसडीएफ 1α केमोकाइन ढाल के संख्यात्मक सिमुलेशन परिणाम। एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।

चित्र तीन
चित्रा 3: microfluidic सेल संस्कृति डिवाइस के अंदर ऑक्सीजन ढाल। प्रयोगात्मक प्रवाह दिशा के साथ सेल संस्कृति कक्ष के भीतर ऑक्सीजन ढ़ाल मापा। ढ़ाल ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील प्रतिदीप्ति डाई और छवि विश्लेषण का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था। ढ़ाल, चैम्बर के बाएं से दाएं, विशेषता है, और परिणाम कक्ष की चौड़ाई भर में लगातार ढाल प्रोफाइल दिखाने।

चित्रा 4
चित्रा 4: प्रयोगात्मक स्थापना की तस्वीरें। microfluidic उपकरणों, सिरिंज पंप, और एक जीवित कोशिका इमेजिंग माइक्रोस्कोप सहित पूरे सेटअप, एक पारंपरिक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर अंदर रखा गया है अनुकूलित के लिएप्रयोगों के दौरान सेल संस्कृति शर्तों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: सेल प्रवास सीधा एसडीएफ 1α और ऑक्सीजन ढ़ाल के तहत अध्ययन का परिणाम है। (क) छवियों से पहले और 12-एच सेल प्रवास के अध्ययन के बाद कब्जा कर लिया। सेल प्रवास रास्तों पर कब्जा कर लिया समय व्यपगत लाइव सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों से विश्लेषण किया जा सकता है। (ख) सेल प्रवास रास्तों और 4 अलग ढाल संयोजन के तहत कब्जा कर लिया छवियों से विश्लेषण औसत प्रवास आंदोलन: नहीं ढाल, केवल केमोकाइन ढाल, केवल ऑक्सीजन ढाल, और दोनों केमोकाइन और ऑक्सीजन ढ़ाल। छवियों हर 15 मिनट पर कब्जा कर लिया गया था। पैमाने बार 250 माइक्रोन है। (ग) सीधा (ऑक्सीजन ढाल) में औसत सेल प्रवास दूरी के भूखंड और क्षैतिज (केमोकाइन ढाल) चार अलग अलग ढाल संयोजन के तहत दिशाओं। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगात्मक सेट से प्राप्त की, ± एसडी मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, और 10 कोशिकाओं प्रत्येक प्रयोग में विश्लेषण किया गया। सांख्यिकीय काफी अलग (unpaired छात्र की टी परीक्षण, पी <0.01) के परिणाम विभिन्न पत्र (ए और बी) द्वारा नामित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एक एम्बेडेड पीसी पतली फिल्म के साथ PDMS microfluidic युक्ति निर्माण करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: (1) सभी बुलबुले को खदेड़ने जब PDMS में पूर्व बहुलक पीसी फिल्म डालने जबकि PDMS-पीसी ऊपर परत fabricating और (2) सुनिश्चित कर रही है सभी PDMS प्रक्रियाओं के इलाज के लिए एक अच्छी तरह से समतल क्षैतिज विमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं। सेल प्रवास प्रयोगों के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: (1) microfluidic युक्ति के भीतर बुलबुले को नष्ट करने, प्रयोगों के दौरान ट्यूबिंग, और सिरिंज पंप; (2) यह सुनिश्चित करना कि microfluidic युक्ति सेल प्रवास के अवलोकन के लिए जीना सेल इमेजिंग के दौरान एक अच्छी तरह से लगाया क्षैतिज विमान पर रखा गया है; और (3) डिवाइस प्रयोगों के दौरान DDH 2 हे पेट्री डिश को जोड़ने और सुनिश्चित करें कि पानी बाहर सूख नहीं है बनाकर moisturized रखने।

आदेश में सफलतापूर्वक delamination बिना PDMS-पीसी संकर microfluidic युक्ति बनाना करने के लिए, यह पीसी फाई के दौरान सभी बुलबुले को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण हैएल एम प्रविष्टि। पीसी फिल्म धीरे-धीरे पूर्व बहुलक PDMS में पीसी फिल्म की प्रविष्टि के दौरान बुलबुले पीढ़ी को रोकने के लिए एक कोण से डाला जा सकता है (पूर्व बहुलक PDMS सतह से लगभग 15 से 30 डिग्री की दूरी पर)। यदि आवश्यक हो, पूरे PDMS एम्बेडेड पीसी फिल्म के साथ पूर्व बहुलक फंस बुलबुले को निष्कासित करने के लिए 10 मिनट के लिए वैक्यूम पंप से जुड़ा desiccator में रखा जा सकता है। पीसी फिल्म वैक्यूम प्रक्रिया के बाद ऊपर तैरता है, तो एक विंदुक टिप ठीक PDMS परत पर पीसी फिल्म नीचे प्रेस करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैक्यूम और प्रेस प्रक्रियाओं को दोहराएँ यदि आवश्यक है।

सेल प्रयोगों के लिए, हवा के बुलबुले की कमी microfluidic सेल संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले पूरे microfluidic सेटअप जब कनेक्शन बनाने (सिरिंज पंप, ट्यूबिंग, और microfluidic युक्ति सहित) में पेश कर रहे हैं। हवा के बुलबुले अनुभव का ऊंचा तापमान के तहत गैस घुलनशीलता की कमी की वजह से microfluidic सेटअप के भीतर बनाई गई हैं, तोमशीन के अंदर riments, सभी प्रयोगात्मक और अभिकर्मकों (मध्यम विकास सहित pyrogallol, और NaOH) (सीरिंज और ट्यूबिंग सहित) घटकों इनक्यूबेटर में पहले से (उपयोग करने के लिए कम से कम 20 मिनट पहले) तापमान भिन्नता को कम करने के लिए रखा जा सकता है । सिरिंज पंप अक्सर भीतर मोटर्स के संचालन से गर्मी पैदा पंप। यह आमतौर पर इन्क्यूबेटरों अंदर सिरिंज पंप संचालित करने के लिए स्वीकार्य है; हालांकि, प्रयोगों के दौरान इनक्यूबेटर तापमान की जांच करना। तापमान प्रयोगों के दौरान उठ हैं, तो अतिरिक्त ठंडा प्रक्रियाओं बाहर ले जाने की जरूरत है। कई संभव ठंडा करने के तरीकों ऐसे इनक्यूबेटर में बर्फ की एक बॉक्स रखने, इनक्यूबेटर के अंदर रखा सिरिंज पंप की संख्या को कम करने, या एक बल शीतलन प्रणाली के साथ एक मशीन का उपयोग कर के रूप में, नियोजित किया जा सकता है।

PDMS-पीसी microfluidic सेल संस्कृति इस पत्र में विकसित डिवाइस मज़बूती से सीधा रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के लिए पैदा करने में सक्षम हैआर सेल प्रवास अध्ययन करता है। विकसित उपकरण की सीमा यह है कि उत्पन्न ऑक्सीजन ढाल प्रोफाइल माध्यम में डिवाइस के माध्यम से, परिवेश वातावरण से ऑक्सीजन प्रवाह, रासायनिक प्रतिक्रिया सफाई द्वारा संचालित है, और ऑक्सीजन प्रसार के बीच संतुलन पर निर्भर करती है, और है। नतीजतन, ऑक्सीजन ढाल प्रोफाइल मनमाने ढंग से डिवाइस के अंदर नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। मौजूदा microfluidic सेल संस्कृति प्लेटफार्मों की तुलना में, डिवाइस इस पत्र में विकसित पहले एक रासायनिक ऑक्सीजन और ढ़ाल के संयोजन के तहत सेल संस्कृति के अध्ययन प्रदर्शन करने में सक्षम है। पूरे डिवाइस थकाऊ संरेखण और महंगा इंस्ट्रूमेंटेशन के बिना पारंपरिक नरम लिथोग्राफी प्रतिकृति मोल्डिंग प्रक्रिया का उपयोग कर गढ़े जा सकते हैं। ढ़ाल संख्यानुसार प्रेरित किया जा सकता है और प्रयोगात्मक इन विट्रो सेल के अध्ययन के लिए अधिक शारीरिक microenvironment जैसी स्थिति प्रदान करने के लिए होती है। एक गैस di के रूप में एक पीसी फिल्म के साथ एक स्थानिक सीमित रासायनिक प्रतिक्रिया पद्धति का उपयोग करकेffusion बाधा, ऑक्सीजन ढाल दबाव गैस सिलेंडरों और परिष्कृत गैस प्रवाह नियंत्रण इकाइयों का उपयोग किए बिना उत्पन्न किया जा सकता है। इसके अलावा, सेटअप (प्रति दिन कम से कम 10 एमएल) रसायनों की ही छोटी मात्रा में ऑक्सीजन ढ़ाल बनाए रखने के लिए की आवश्यकता है। चूंकि ऑक्सीजन तनाव नियंत्रण microfluidic चैनल के चारों ओर स्थानीय स्तर पर ही सीमित है, और परिवेश ऑक्सीजन एकाग्रता परेशान नहीं करता है, पूरे सेटअप अतिरिक्त तापमान, आर्द्रता के बिना एक पारंपरिक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के अंदर रखा जा सकता है, और सीओ 2 नियंत्रण उपकरण। नतीजतन, विकसित डिवाइस महान क्षमता व्यावहारिक रूप से जैविक प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा रहा है।

तकनीकी सीमाओं के कारण, ऑक्सीजन तनाव के तहत सेलुलर व्यवहार शायद ही कभी मौजूदा साहित्य में अध्ययन किया गया है। इस पत्र में विकसित इस उपकरण की मदद के साथ, ऑक्सीजन ढ़ाल के तहत सेल संस्कृति एक सतही तरीके से कि बहुत ऑक्सीजन ढ़ाल के तहत सेल के अध्ययन को बढ़ावा देता में प्रदर्शन किया जा सकता है। furthermore, एक समान आपरेशन सिद्धांत के लिए इन विट्रो सेल संस्कृति 17 अध्ययन, जैसे कार्बन डाइऑक्साइड और नाइट्रिक ऑक्साइड के रूप में अन्य physiologically प्रासंगिक गैसीय ढ़ाल, उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है। इन क्षमताओं है कि PDMS-पीसी microfluidic युक्ति, औषधि परीक्षण और सेल प्रसार और प्रवास assays सहित विभिन्न सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए महान क्षमता का पता चलता विट्रो सेल संस्कृति के अध्ययन में अग्रिम करने के लिए प्रदर्शित करता है।

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml Syringe Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 302104
1.5 ml Microcentrifuge Tube Smartgene 6011-000
10 ml Syringe Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 302151
15 ml Centrifuge Tube ThermoFisher Scientific,Waltham, MA Falcon 352096
150 mm Petri dish Dogger Science DP-43151
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane Alfa Aesar, Ward Hill, MA 78560-45-9
3 ml Syringe Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 302118
4'' Silicon Dummy Wafer Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan
Acetone ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan AH3102-000000-72EC
AG Double Expose Mask Aligner M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan AG500-4D-D-V-S-H
Antibiotic-Antimyotic solution ThermoFisher Scientific,Waltham, MA GIBCO 15240-062
Biopsy punch Miltex, Plainsboro, NJ 33-31
Blunt needle JensenGlobal, Santa Barbara, CA Gauge 14
Bright-Line Hemocytometer Sigma-Aldrich, St. Louis, MO Z359629 for cell counting
Buffered Oxide Etch ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan PH3101-000000-72EC
Cell Culture Incubator Caron, Marietta, OH 6016-1
COMSOL Multiphysics COMSOL, Burlington, MA Ver. 4.3b for numerical simulation of chemical gradients in the device
D-PBS ThermoFisher Scientific,Waltham, MA GIBCO 14190-144
Desicattor A-VAC Industries, Anaheim, CA 35.10001.01
DMEM/F12+GlutaMax-1 ThermoFisher Scientific,Waltham, MA GIBCO 10565-018
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific,Waltham, MA GIBCO 10082
Fibronectin from Human Plasma Sigma-Aldrich, St. Louis, MO F2006
Inverted Fluorescence Microscope Leica Microsystems, Wetzlar, Germany DMIL LED
Isopropyl Alcohol (IPA) ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan CMOS112-00000-72EC
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager NanoEnTek, Seoul, Korea DBJ01B
Mechanical Convention Oven ThermoFisher Scientific,Waltham, MA Lindberg Blue M MO1450C
NaOH Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan 1943-0150
Plasma tretment system Nordson MARCH, Concord CA PX-250 for oxygen plasma surface treatment
Polycarbonate (PC) film Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan
Polydimehtylsiloxane (PDMS) Dow Corning, Midland, MI SYLGARD 184
Pyrogallol Alfa Aesar, Ward Hill, MA A13405
Removable Adhesive Putty 3M 860
Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge ThermoFisher Scientific,Waltham, MA
Spin Coater ELS Technology, Hsinchu, Taiwan ELS 306MA
SU-8 2050 MicroChem, Westborough, MA SU-8 2050
SU-8 Developer MicroChem, Westborough, MA Y020100
Surgical blade Feather, Osaka, Japan 5005093 for PDMS cutting
Syringe Pump Chemyx, Houston, TX Fusion 400
T75 Cell Culture Flask ThermoFisher Scientific,Waltham, MA Nunc 156367
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific,Waltham, MA 15250061
Trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific,Waltham, MA GIBCO 25200
Tygon PTFE Tubing Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH
Tygon Tubing Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH 621

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References

  1. Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J. Engineering graded tissue interfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (34), 12170-12175 (2008).
  2. Wang, F. The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).
  3. Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).
  4. Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).
  5. Chung, B. G., et al. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).
  6. Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
  7. Allen, J. W., Bhatia, S. N. Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).
  8. McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).
  9. Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).
  10. Chang, C. W., et al. A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).
  11. Chen, Y. A., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).
  12. Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).
  13. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).
  14. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
  15. Cordelières, F. P. Manual Tracking. , Institute Curie. Orsay, France. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2005).
  16. Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf (2013).
  17. Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104 (2013).

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