Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לעיבוד המהיר של דגימות גליומה pontine מהותיות מפוזרות שלאחר מוות להקמת מודלי תרבית תאים שמקורם בחולה או אפיון ישיר של תאים סרטניים microenvironmental.
Abstract
מפוזר עצמותית Pontine Glioma (DIPG) הוא גידול בגזע המוח בילדות שנושאת פרוגנוזה קטלנית אוניברסלית. בגלל כריתה כירורגית אינה אסטרטגית טיפול קיימא הביופסיה אינה נעשית באופן שיגרתי, את הזמינות של דגימות חולות למחקר מוגבלת. כתוצאה מכך, מאמצים ללמוד את המחלה הזאת כבר לערער על ידי מיעוט של מודלי מחלה נאמנים. כדי לתת מענה לצורך זה, אנו מתארים כאן פרוטוקול לעיבוד המהיר של דגימות רקמת נתיחה שלאחר מוות על מנת ליצור מודלי תרבית תאי חולה נגזרת עמידים שיכול לשמש מבחני חוץ גופייה או in vivo ניסויי xenograft orthotopic. מודלים אלה יכולים לשמש מסך עבור מטרות תרופה פוטנציאל ללמוד תהליכי pathobiological מהותיים בתוך DIPG. פרוטוקול זה ניתן להאריך עוד יותר לנתח לבודד תאים סרטניים microenvironmental באמצעות Cell מופעל קרינת מיון (FACS), המאפשר ניתוח בדיעבד של אקס גןpression, ביטוי חלבון, או שינויים אפיגנטיים של הדנ"א בתא בתפזורת או ברמת תא בודד. לבסוף, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם כדי ליצור תרבויות נגזרות מטופלות עבור גידולים במערכת עצבים מרכזיים.
Introduction
DIPG הוא ממאירות במערכת עצבים מרכזיות אגרסיביות שעולות פונס הגחון, בדרך כלל במהלך אמצע ילדות 1, 2. למרות עשרות שנים של ניסויים קליניים, הטיפול הנוכחי מוגבל רדיותרפיה, המספקת שיפור זמני או ייצוב של סימפטומים ורק מרחיב הישרדות החציוני בשיעור ממוצע של 3 חודשים. אפילו עם הקרנות, חציון הישרדות כוללת היא רק 9 חודשים עם 90% מהילדים מתים מהמחלה בתוך 2 שנתי אבחנה ראשונית. בגלל אופי infiltrative של גידול ואת הפונקציות הקריטיות של גזע המוח, כריתה כירורגית אינה אפשרית. יתר על כן, בארצות הברית, קבלת ביופסיות כירורגיות עבור DIPG יש היסטוריה לא בוצע 3, כמו ניתוח histopathological אין תפקיד נוכחי המנחה טיפול ואבחון קליניים יכול בדרך כלל להתבצע על ידי הדמייה לבד. לפיכך, על זמינותו של f רקמת הגידולאו מחקר מוגבל, הגבלת מאמצים לערוך מחקר על מולקולות תרופה מועמדות לבין ביולוגית גידול הבסיסית. יש לציין, שיפורי טכניקות הדמייה ו stereotactic אפשרו לפיתוח ביופסיות בטוחות של DIPG בשנים האחרונות 4, אשר, בשילוב עם התקדמות בביולוגיה מולקולרית, שינו את הבנתנו של המחלה. נכון לעכשיו, ניסויים קליניים מרובים באמצעות ביופסית upfront ו פרופיל מולקולרי של DIPG עבור individualizing תוכניות טיפול נמשך (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG ו גליומות בדרגה גבוהה ילדים אחרות מייצגים מחלות נפרדות מעמיתיהם גליובלסטומה בוגרי 6, 7, ובכך הדגמים ניסיוניים נאמנים של DIPG נחוצים כדי להבין פתופיזיולוגיה ייחודי ולגלות אסטרטגיות טיפוליות יעילות. בשנים האחרונות, התמקד מאמצים להשיג גידול DIPG tנושא למחקר בעת הנתיחה או, פחות נפוץ, ביופסיה חוללה מהפכה בהבנתנו ויכולת ללמוד DIPG. הגנום כולו רצף המאמצים גילה מוטציה חוזר בענפי היסטון H3, 3A המשפחה (H3F3A) ו היסטון אשכול 1, H3b (HIST1H3B), המייצג את הדוגמה הראשונה של מחלות אנושיות נגרמת על ידי מוטציות היסטון קידוד חלבונים 8, 9, 10, 11 . יתר על כן, קבוצת משנה של DIPGs מבטא מוטציות בגן ACVR1, אשר לא דווחו בעבר בסרטן אך זהים מוטציות נמצא ossificans fibrodysplasia הפרעה התפתחותית מולדת הילדות progressiva 8, 9, 10, 11. כמו כן, בתרביות תאי DIPG חולת הנגזרות הראשונות מו xenograft orthotopicdels החברה הוקמו 1, 2, 12, 13, 14, וכן מודלים עכבר הוקמה באמצעות השתלה שלא מבן-מינו ישירה של תאים סרטניים לעכברים immunodeficient כדי ליצור xenografts סדרתי 3, 14, 15. מאמצי הקרנת סמים ראשוניים שהתקבלו בעזרת מודלים חולים נגזר אלו זיהו סוכני רומן מבטיחים לתרגום קליני 4, 14 ו הניחו את היסודות לפחות ניסוי קליני אחד (NCT02717455).
הצעדים הראשונים אלה אל הקדמה הם רק ההתחלה, דגימות רקמות מטופל נגזרות רבות ומודלי התרבות תהיינה צורך להגדיר תת סוגים של המחלה ולפתח את האסטרטגיות טיפוליות היעילות ביותר. מנוע גנטימודלי עכבר ered של DIPG יהיו גם להקל מחקרים שמטרתם לקדם את ההבנה הבסיסית שלנו של המחלה. מאמצים שנעשו כדי ליצור מודלים גנטיים DIPG יסתייעו המחקרים גנומי היסוד שנדונו לעיל, אך כיום מספר מצומצם של אפשרויות זמינים. אחד כזה מודל, אשר מייצר גליומות בגזע המוח בדרגה גבוהה דומה היסטולוגית, משתמשת RCAS / tv-נגיפי מערכת לנהוג ביטוי יתר PDGF-B ואובדן Ink4a-ARF בתאים חיובית-nestin ב השקע האחורי של עכברים בילוד 5, 16. גישה נוספת כרוכה משחזרת מוטציות DIPG הקשורים מרכזיים (מוטציה K27M H3.3 היסטון, אובדן p53 ו PDGFRA ההפעלה) בתאים עצביים מבשר שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים, וזה מספיק כדי להבהיר תאים אלה 6 tumorigenic, 7, 17. השילוב של שיטות גנטיות וסבלני-derivמודלי ed ייאפשרו בניסויים פרה-קליניים ולקדם את הפיתוח של טיפולים יעילים.
כדי לענות על האתגרים למחקר DIPG שפורט לעיל, פרוטוקול נתיחה מהיר זו פותח כדי ליצור תרביות תאים שמקורם בחולה לחקירה 8, 9, 10, 11, 12, 14. הפרוטוקול נועד להגן על הכדאיות של הרקמות למקסם את הסיכוי של יצירת תרבויות עמידות למרות האתגרים הקשורים במרווחים וזמן תחבורה מורחבים שלאחר מוות. כאשר נוצרו בהצלחה, תרבויות DIPG אלה יכולים לשמש מניפולציות הבאות במבחנה ובניסויי xenograft vivo, המאפשרות הערכה של מולקולות טיפוליות פוטנציאל על תאים שמקורם בחולה.
Protocol
פרוטוקול זה בוצע באישור ועדת הבדיקה המוסדית שלנו עם זיהוי-דה המתאים של כל הנתונים המטופלים ובהתאם לכל מוסדיים, לאומיים, והכללים בינלאומיים עבור רווחת אדם. השג כל אישור הדירקטוריון סקירה מוסדי מתאים והסכמתם ממשפחת החולה לפני עבודה עם פרוטוקול זה.
1. קבלת דגימות רקמה
הערה: רכיב קריטי של פרוטוקול זה דורש טיפול הנאות של תרומת הרקמות החלה מייד בעת הנתיחה. הכדאיות המדגמת תלויה באופן משמעותי על מזעור המרווח פוסט-מורטם (PMI), מייד להעביר את הרקמה לתוך המדיום הקר המתאים בתוספת אנטיביוטיקה / antimycotics, לשמירת הדגימה על קרח רטוב לאורך תחבורה, ושמירת טכניקה סטרילית ברחבי הפרוטוקול.
- עם ההודעהשל תרומה ממשמשת ובאה, להכין ערכת אוסף מדגם. באמצעות תיבת משלוח עם מכל מבודד, שניתן להשתמש בם ישירות לתחבורת חזרת דגימת הרקמה, כוללים את החומרים הבאים:
- כוללים חומרים להכנת סטרילי, כולל כפפות סטריליות, וילונות, ניתוחים.
- כלול 8 - 10 צינורות חרוטי סטרילי 50 מיליליטר המכילים 30 תקשורת משלוח מיליליטר במכל המבודד עם קרח או חבילות קרות.
הערה: למרות כל אמצעי תקשורת תרבית תאים סטנדרטי יכול לעבוד, את כדאיות המדגם הטובה ביותר מתקבלת עם Hibernate-A בתוספת אנטיביוטיקה / antimycotic. - הקפד לכלול את כל דוגמיות נוספות עבור ניתוחים אחרים (למשל, fixatives).
- אם הנתיחה לא תבוצע על אתר החוקר, כולל מסמך קובע בבירור כיצד לאסוף את דגימת הגידול. זה כולל פרטים כגון שמירה על סטריליות, שמירה דוגמיות על קרח רטוב, וכולל דגימות מן המוח התיכון ומדולה כמו tuמור תאים לעתים קרובות לפלוש לאזורים אלה.
- לשמור על סטריליות במהלך הנתיחה. קח למשל את המוח סטרילי בתוך הגולגולת, כך להתבונן טכניקה סטרילית (לרבות כפפות שינוי) פעם הגולגולת פתוחה. הימנעות זיהום עם עור ושיער היא קריטית.
- לנתח את הגידול מן הצד הגחוני ( "הבטן" של פונס, לראות משלימה איור 1). עם אזמל סטרילי, לחתוך לחתיכות קטנות 1 סנטימטר מן הגידול ומייד להעביר לתוך תקשורת משלוח קרה (ראה הערה בשלב 1.1.2) ולשים על קרח רטוב. מקום 10 מ"ל של רקמה לתוך צינור אחד, וכתוצאה מכך נפח סופי של רקמות התקשורת בצינור אחד של 40 מ"ל.
הערה: במקרה של DIPG, הגידול מתפזר מחלחלת פונס ולעתים קרובות שאר המוח. ככזה, לאסוף כמה שיותר מדגם ככל האפשר, בדרך כלל כולל 3 - 4 צינורות (30 - 40 רקמות מ"ל) מ פונס 1 - 2 צינורות (10 - 20 רקמות מ"ל) כל מ המוח התיכון ומדולה. - אסוף סםPles מן המוח התיכון ומדולה חופף אל פונס, אשר בדרך כלל מכיל תאים סרטניים רבים.
- לאחר איסוף דגימה, לשלוח את דגימות O / N על קרח רטוב במיכל מבודד. לא עושה משלוחים המדגמים על קרח יבש, כמו הקפאה תהרוג את התאים.
2. הכנה עבור עיבוד מדגם
- לפני תחילת הכנת מדגם, לעקר ברדסים בתרבית רקמה יחד עם סכיני גילוח, hemostats המעוקל, וכל כלי שאינו סטרילי אחר תחת אור UV במשך שעה 1. בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים על מנת למנוע זיהום של תרבויות.
- כן ופתרונות סינון סטרילי.
- כדי להכין 1.8 M תמיסת סוכרוז, לפזר סוכרוז 308.07 גרם 300 מ"ל מים מזוקקים. הוסף 50 מ"ל 10x Hank's שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) ללא סידן או מגנזיום ולהביא הנפח הכולל עד 500 מ"ל באמצעות מים מזוקקים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- כדי להכין פתרון עיכול אנזימטי, לקחת 50 מ"ל HBSS עם סידן ומגנזיום על כל 10 מ"ל של רקמות טחון ולהוסיף 500 μL 5 מ"ג / מ"ל deoxyribonuclease אני (מיקרוגרם 50 לריכוז סופי / מ"ל), 500 μL 2.5 מ"ג / מ"ל collagenase I / II פתרון dispase (הריכוז הסופי 25 מיקרוגרם / מ"ל), ו -500 μL 1 M HEPES חיץ. פתרון העיכול Prewarm באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- כדי להכין התקשורת גזע סרטניים (TSM) בסיס, לערבב 250 מ"ל Neurobasal-A, 250 בינוני הנשר שונה של מ"ל Dulbecco: F12 תערובת מזון (DMEM / F12), 5 אנטיביוטיקה antimycotic 100x מ"ל, 5 מ"ל 200 מ"מ L- alanyl-L- dipeptide גלוטמין (Glutamax-A), 5 חיץ מ"ל HEPES, 5 פירובט נתרן מ"ל 100 מ"מ, ו -5 חומצות אמינו מ"ל 100x MEM שאינם חיוניים.
- כדי להכין מלא TSM עם גורמי גדילה, להוסיף התוספים הבאים לבסיס TSM: 50x B27 מוסף מינוס ויטמין A (1:50), גורם גדילה באפידרמיס אדם (H-EGF, 20 ng / mL), פקטור גדילה אנושי פיברובלסטים (H- FGF, 20 ng / mL), AA גורם הגדילה טסיות הנגזרות האנושי (H-PDGF-AA, 10 ng / mL),טסיות הנגזרות האנושי Growth Factor BB (H-PDGF-BB, 10 ng / mL), והפתרון הפרין (2 מיקרוגרם / מ"ל).
- Precool בצנטריפוגה מעבדה מצוידת עם הרוטור מתנדנד דלי ל- C ° 4.
3. ניתוק מכני
- העברת רקמה לתוך צלחת תרבית תאים גבוהה מוקפת חומה 100 מ"מ x 20 מ"מ. הסר שאריות מדיה המשלוח ולהחליף עם 10 - 15 מיליליטר תקשורת והתרבות קרה.
- באמצעות hemostats מעוקל לתפוס סכין גילוח, לקצץ את הרקמה דקה תוך הסרת כלי או קרומי מוח דם ברורים.
הערה: שברי רקמות הסופי צריך להיות קטן מ -1 מ"מ (ראה איור 1B). - העברת רקמה לתוך צינור 50 מ"ל חרוטי נקי. שטוף את צלחת תרבית תאים עם תקשורת והתרבות קרה נוספת 5 מיליליטר ולהעביר צינור החרוטים. חזור על שלב זה לשטוף לפי הצורך להעביר רקמה נותרת.
- שימוש pipet 10 מ"ל סרולוגית, triturate בעדינות (4 - 5 פעמים). אפשר Tiss גדולשברי ue כדי ליישב לתחתית של התחתית. במידת הצורך, צנטריפוגות מדגם בקצרה דקות 1 (350 XG, 4 ° C).
- אסוף את שבריר ניתק מכנית.
- הסר את supernatant ולסנן אותה דרך פילטר 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל שכותרתו "ניתוק מכני." הפוך את המסנן מעל צינור החרוטים המקורי ולשטוף עם תקשורת והתרבות להתאושש שברי רקמה.
- צנטריפוגה שבר "ניתוק מכני" במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C).
- הסר את supernatant מן שבר pelleted "הניתוק המכאני" ו resuspend הרקמות בתקשורת התרבות הקרה. אם יש יותר מ 5 מ"ל של רקמת בצינור חרוטי "ניתוק מכני", לפצל את הרקמה לתוך צינורות חרוטי אחרים 50 מ"ל כך אין צינור יותר מ -5 רקמות מ"ל.
- אחסן את השבר המכאני ניתק על קרח עד שלב צנטריפוגה שיפוע סוכרוז (Steעמ '5). לחלופין, את החלק היחסי ניתק מכנית יכול להמשיך לשלב 5 במהלך תקופת הדגירה דיסוציאציה האנזימטית (שלב 4.4).
4. אנזימתי דיסוציאציה
- אם יש יותר מ 5 מיליליטר של רקמה בצינור המכיל שברי הרקמה הנותרים הגדולים, לפצל את הרקמה לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל חדשים אחרים כגון שאין לו צינור יותר מ -5 רקמות מיליליטר.
- צנטריפוגה צינור חרוטי (ים) המכיל את שברי הרקמה הנותרת במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C).
- הסר את supernatant ולהוסיף הפתרון עיכול אנזימטי prewarmed, כך שיש פתרון העיכול מ"ל 5 עבור 1 בכל רקמות מ"ל (למשל, 25 פתרון העיכול מ"ל במשך 5 רקמות מ"ל).
- חותם את עפעפי צינור חרוטים עם סרט מעבדת דגירת התגובה על כתף על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לאחר דגירה, triturate דגימות בעדינות (ראה תרשים 1C).
- שימוש pipet 10 מ"ל סרולוגית,pipet למעלה ולמטה מדגם 6 - 8 פעמים. למנוע יצירת בועות אוויר חריגות.
- הוספת טיפ pipet 1,000 μL עד הסוף של pipet ו triturate 6 נוסף - פעמים 8.
- אפשר כל גושים נותרים כדי ליישב לתחתית של התחתית. הסר ולסנן את supernatant עם התאים עדיין מושעה דרך פילטר 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל שכותרתו "דיסוציאציה אנזימתי" ולאחסן על הקרח.
- אם שברי הרקמה משמעותי להישאר, להוסיף תוספת של 10 מ"ל HBSS עם סידן ומגנזיום כדי שברי וחזור על שלבים 3.5.1 ו 3.5.2. סנן הפתרון הסופי הזה דרך פילטר 100 מיקרומטר לתוך הצינור "דיסוציאציה אנזימתי".
- צנטריפוגה הצינור "אנזימתי דיסוציאציה" במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C) ולהמשיך צנטריפוגה שיפוע סוכרוז.
5. סוכרוז Gradient צנטריפוגה
- אם דגימות עדיין מושעים בתמיסה, centrifuGE במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C).
- הסרת רקמה supernatant ו resuspend ב 20 מ"ל HBSS קר ללא סידן ומגנזיום. להעלות נפח 25 מ"ל סה"כ עם HBSS קר.
- לאט לאט להוסיף 25 מ"ל 1.8 M פתרון סוכרוז להפוך את הצינור לערבב. התוצאה היא שיפוע סוכרוז 0.9 M.
- צנטריפוגה ללא בלם במשך 10 דקות (800 XG, 4 ° C). באמצעות בלם צנטריפוגה ישבש את שיפוע ולהפחית תשואה (ראה איור 1D עבור דוגמה מדגם לפני ואחרי צנטריפוגה).
- בזהירות לשאוב פסולת המיאלין תמיסת סוכרוז ככל האפשר. לשטוף את המדגם על ידי הוספת 30 מ"ל HBSS קר ללא סידן ומגנזיום ערבוב בעדינות. צנטריפוגה במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C).
6. תמוגה תא ACK אדום דם
- הסר את supernatant לשטוף. הוסף 5 מ"ל חיץ ACK תמוגה בעדינות resuspend התא גלולה, מתערבל הצינור דקות 1 ב RT.
- להרוות את lיסיס על ידי הוספת 30 מ"ל HBSS קר ללא סידן ומגנזיום.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C).
7. תחזוקת תרבות ראשונית
- Resuspend את כדורי התא האחרונים 10 - 15 מיליליטר החם מלא TSM עם גורמי גדילה ולכמת צפיפות תאי קיימא על hemocytometer באמצעות הרחקת trypan כחולה.
הערה: הטווח של תאי קיימא משתנה מאוד בהתאם לנסיבות של תרומת הרקמות, וכימות יכול להיות קשה בשלב זה מוקדם בשל פסולת הסלולר שאריות. בשנת מקרה אידיאלי, שואף להיות ממיליון תאי חיים לדגימה. במקרים בהם פסולת מוגזם נשאר, צלחת בצפיפות נמוכה בבקבוק T175. - מעביר את מתלי תא הסופיים בקבוק תרבות T75 חדש. ספייק בגורמי גדילה נוספת כל יומיים כדי לשמור על רמות גורם הצמיחה הכוללת, ולפקח לפיתוח neurospheres תאים סרטניים (ראה איור 1E ואיור 2).
- לחלופין, תהליך ניתק enzymatically תאים לניתוח נוסף, כולל זרימת cytometry ומיון תאים המופעל הקרינה.
- לאחר הפיתוח של neurospheres (אשר בממוצע לוקח 3 - 4 שבועות, אך נע בין כמה ימים כדי עוד 2 חודשים), הפוך מסננת המדגם באמצעות מסנן רשת ניילון 100 מיקרומטר להפחית את כמות הפסולת.
הערה: התסנין צריך להישמר בתרבות במקרה תאים בודדים קיימא או כדורים קטנים נוכחים. - שמירה על טוהר המידות ועל טוהר התרבות על ידי ביצוע DNA טביעת אצבעות תוך passaging, בהשוואת מדגם המטופלים הראשוני.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר הוא לסכם עבודה בן חמישה שלבים עם תמונות של הרקמות בשלבים שונים של עיבוד באיור 1. הדגימה נלקחת ראשונה באמצעות נתיחה סטרילי מהירה. במהלך ניתוק מכני, הרקמה טחון תוך הסרת כלי דם בקרום המוח מן המדגם, ולסנן דרך פילטר רשת ניילון 100 מיקרומטר. שברי הרקמה הנותרים ניתק enzymatically בתנור ההתחממות. לאחר מכן, פסולת מופחת תוך צנטריפוגה שיפוע סוכרוז, לבודד שכבה מובחנת של המיאלין מן המדגם. בנוסף, תמוגה ACK בעליל מקטינה את כמות תאי דם אדומים נוכחיים במדגם. לבסוף, התאים הם מצופים סרום ללא מדיה בתוספת גורמי גדילה.
משלימה איור 1 הוא דוגמה של הגידול על הנתיחה. הגידול גדל כמו חדירה מפוזרת של פונסד האזורים הסמוכים של גזע המוח. במהלך ההכנות מדגם, קטן ~ 1 ס"מ x 1 ס"מ נתחי יש לחתוך והניח מיד לתוך התקשורת משלוח קר על הקרח.
תרשים 2 מציג דוגמאות שונות של איך הדגימות יכולות להופיע החל מהשלבים המוקדמים של culturing לתרבות עמידה. בתחילה מצופה ותרבויות מוקדם (A, B) לעתים קרובות אינו מופיע להכיל תאים ששרדו רבים. יתר על כן, צבירי תאים מוקדם (C, D) לעתים קרובות אינם מציגים את המידה בניגוד הקשורות בדרך כלל neurospheres. יש לציין, כי משך הזמן בתרבות לפני הופעתו של צבירי תאים יכול לקחת שבועות עד כמה חודשים. עם זאת, את המעבר הראשוני של צבירי תאים אלה, בשילוב עם סינון הפוך של צבירי תאים, יכול לבודד תאים סרטניים בריאים כי הם מסוגלים ליצור כדורים (F). התסנין (E) בדרך כלל מכיל פסולת שאריות; עם זאת, אנו ממליצים ציפוי ושמירת התסנין וניטור עבור התפתחות צבירי תאים. חולה הנגזרת אלה דגימות אז יכולות להישמר בתרבות קטעים מרובים (G, H).
איור 3 מדגים את היכולת של תאים אלה להיות xenografted לעכברים. בכל אחד מהמקרים הללו, התאים DIPG היו transfected עם כתבת ה- GFP-בלוציפראז לעקוב אחר ההתפתחות של גידולים באמצעות פליטת אור (א). הגידולים יכולים גם להיבחן היסטולוגית, למשל להתבונן engraftment הגידול (ב) או ביטוי של סמנים ספציפיים (C). במודלים vivo אלה, בשילוב עם מבחני חוץ גופית ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעות של תרופות שונות או מניפולציות הגן (למשל, 8, 9, 10, 11, 14).
les / ftp_upload / 55,360 / 55360fig1.jpg "/>
דגימות רקמה באיור 1. בשלבים שונים של עיבוד. (א) תשיג מדגם דרך בנתיחת גופות סטרילי ומשלוח לילה על קרח רטוב. (ב) משמאל לימין: (שורה 1) צינורות המכילים רקמת הגידול במדיה המשלוח; רקמה טרי בצלחת תרבית תאים 100 מ"מ x 20 מ"מ; מתייפייף ראשוני של רקמות; (שורה 2) רקמת טחון חלקית; הסרת קרומי המוח וכלי דם; גודל סופי של פיסות רקמה טחונות. (C) משמאל לימין: (שורה 1) רקמת מודגרות על שולחן סובב בתנור 37 מעלות צלזיוס; (שורה 2) טחינה דקה של רקמה באמצעות טיפ pipet μL 1000 המצורפת pipet 10 מ"ל; סינון של רקמות ניתקות דרך פילטר רשת ניילון 100 מיקרומטר. (ד) משמאל לימין: ניתק מושעה רקמות בתמיסה 0.9 M סוכרוז לפני צנטריפוגה; רקמה ניתקת מופרדת על פני שיפוע סוכרוז לאחר צנטריפוגה; על o שכבה גלויהפסולת המיאלין f על גבי שיפוע סוכרוז; גלולת תא סופית לאחר תמוגה לשטוף ACK. (E) המדגם הסופי יכול להיות ממוקם בתוך תרבות או להשתמש בניתוחים במורד אחרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תמונות של תרבויות עיקריות תאים מעבר מוקדם. (א - ב) תרבויות מצופות מייד לאחר הניתוק (SU-DIPG-XXX, א), או כי לא גדל neurospheres עדיין (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) הופעה מוקדמת של neurospheres בתרבויות העיקרי של SU-DIPG-XXVIII (C) SU-DIPG-XXIX (D). (EF) קטע הראשון של התרבות העיקרית מ D באמצעות מסנן ניילון 100 מיקרומטר, עם filtrate (E) ו תסנין הפוך (F) מצופה. (G - H) neurospheres בוגרות מן הקטע הראשון של SU-DIPG-כז (G) ואת המעבר השלישי של SU-DIPG-XXV (H) גדל בתרבות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תא תרבויות נגזר מטופל יכולות נקלטות וצורת גידולים בעכברים. (א) תמונות פליטת אור של ארבע בתרביות תאים שונות נגזרות חולות טרנספקציה עם כתבת ה- GFP-בלוציפראז. (ב) סעיף sagittal מתוך xenograft העכבר, מראה תאים סרטניים engrafted ב פונס העכבר. גרין: GFP, אדום: חלבון המיאלין הבסיסי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (C) immunofluores דוגמהתמונה דעך מראה תאים סרטניים GFP engrafted במוח העכבר. כחול: DAPI, גרין: GFP, אדום: IGF2R. בר סולם = 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
משלימה איור 1. לדוגמא הנתיחה של גידול Pontine. המראה שלאחר מוות מיידי של גליומה pontine המהותית מפוזרת. הגידול מופיע כגוש גדול ועתיר המיאלין על פני שטח הגחון של פונס. אנא לחץ כאן כדי להוריד את התמונה.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה לעיבוד מהיר של תרומות רקמת הגידול שלאחר המוות לפתח בתרביות תאים שמקורם בחולה, אשר ניתן להשתמש בהם במגוון במבחנה או בניסויים vivo. בשל אופיו של עבודה עם דגימות הנתיחה, שמירה על כדאיות מדגם מציבה אתגר משמעותי. מספר גורמים תורמים, כולל מרווח שלאחר המוות לבצע נתיחה או את הזמן הנדרש להובלת רקמות, יש לצמצם ככל האפשר, אך לעתים קרובות קשה לשלוט. מניסיוננו, מרווח שלאחר מוות של פחות מ 6 - 8 שעות (מרגע מות הזמן כי רקמת ממוקם משלוח קרים כקרח ומדיה תחבורה) הניב את הסיכוי הטוב ביותר של הקמת תרבית תאים עמידה. עדיף אז לקבל את הרקמות לבדיקה במעבדה תוך 24 שעות, ו לעבד אותו לתרבות מיד עם קבלתן.
מאז המיקום של אלה מקרים נדירים משתנה מאוד, ואיכות הצעד יחזור רקמה מאוד משפיעה על סיכויי הצלחה, הלוגיסטיקה של ביצוע הנתיחה יכולה להיות מאתגרת. במקרים רבים, על מנת להשיג את מסגרת זמן 6-8 שעות, זה לא ריאלי לנהל את קציר הרקמות לעבר מרכז אקדמי. במקום זאת, שיש לשירות שחזור רקמות תורן לשחזר את רקמת הגידול בבית ההלוויות תחת פרוטוקול שאושר IRB הוא לעתים קרובות יותר ומועיל להתאוששות רקמות. קבלת הסכמה מדעת מראש מוות מומלצת ומקל על התכנון הלוגיסטי. הכנת ערכות נתיחה עצמאית עם הוראות ברורות ויסודיות ואספקה סטרילית לאחזור רקמות (כפפות, וילאות, אזמלים) מומלץ בחום. בנוסף, הקמת נקודות ברורות של תקשורת בין החוקר, פתולוג, ואת בית הלוויות היא קריטית. לדוגמה, החוקר צריך לדון פרוטוקול עם הפתולוג לפני הנתיחה ולהאיר שגיאות נפוצות. שגיאות אלה כוללים מיקרוביאל זיהום (בדרך כלל שמרים) במהלך אחזור רקמות, אי הספינה באמצעות משלוח לילה / מזורז וכישלון לשלוח את המדגם על הקרח רטוב מספיק במיכל thermoinsulated. לבסוף, אנו ממליצים להשתמש שירות שליחים מדלת לדלת למשלוח של המדגם כדי לצמצם את זמן ההובלה.
טיפול צריך גם לקחת במהלך דיסוציאציה רקמות לשמר כדאיות התא. למשל, השימוש במדים שנועד לשמר בריאות רקמה עצבית לתחבורה (Hibernate-A בתוספת אנטיביוטיקה / antimycotic) יגדיל את הסיכוי של יצירת תרבות מוצלחת. כמו כן, חשוב לשמור על המדגם בטמפרטורה קרה לאורך כל הפרוטוקול תמיד על ידי העברת דגימות קרח. איסוף שני שברי הניתוק מכאניים ו האנזימטית יחד עם מזעור טחינה דק יכול לשפר את הצלחת פרוטוקול, כמו שני השלבים הללו טראומתיים לתאים. מניסיוננו, בעוד תרבויות המצליחים ביותר לצמוח מתוך שני שברים, היו לנו מקרים שבם רק אחד משתי ההכנות הוקם תרבות עמידה, פוטנציאל המשקף את האופי העדין של דגימות אלה. עוד צעד טראומטי בפרוטוקול הוא טחינה דקה; אסטרטגיה אחת שיכול לצמצם את מידת הטחינה הדקה צורך היא להבטיח את הדגימות טחונות ביסודיות ממש בהתחלה של התכשיר. דוגמאות נוספות של היבטים של הפרוטוקול שנועד לשפר את הכדאיות המדגמת כוללות מאגרי הוספה (למשל, HEPES) ברחבי הפרוטוקול, אשר הוא קריטי במיוחד במהלך דיסוציאציה האנזימטית.
שינוי אפשרי של פרוטוקול זה להגדיל כדאיויות תא נוסף הוא הסר של הצעד ימס כדוריות הדם אדום ACK. עם זאת, במקרה זה, הוא לעתים קרובות אז יש צורך לבצע צעד תמוגה ACK במהלך השבוע הראשוני בתרבות להסיר תאי דם אדומים. היבט נוסף של פרוטוקול זה שעשוי להיות שונה הוא חיסול המיאלין ופסולת הסלולר באמצעות densit סוכרוזשיפוע y. באופן ספציפי, אסטרטגיות אחרות דווחו לשפר כדאיויות תא של תאי microglial גם אפשריות בשלב זה, כגון שיפוע צפיפות רציף Percoll 18 או חרוזי הסרת המיאלין מגנטיים.
לבסוף, המשך בין דיסוציאציה רקמות הראשונית והופעת neurospheres משתנה בין דגימות יכול לקחת בין שבוע לחודש או יותר. מאז התרבויות הראשוניות בדרך כלל מכילות מידה משמעותית של תאים מתים ופסולת הסלולר, זה יכול להיות מאתגר לקבוע אם תאי קיימא להישאר; התרבות צריכה להישמר במשך לפחות 4 - שבועות 8 (איור 2). אסטרטגיה אחת לבידוד תאי גדלים מן ההריסות שנותרו מוצגת כאן (כלומר להפוך סינון צבירי תאים מחדש ציפוי בתקשורת טריה). ההחלטה אם להמשיך לשמור על תרבות היא בסופו של דבר החלטה כל מקרה לגופו בהסתמך על גורמים סביב הדואר נתיחה (למשל, מרווח שלאחר מוות ממושך, בעיות במהלך הובלת רקמות), ניתוק הרקמות (למשל, דם מוגזם או פסולת), ואיך המדגם מופיע בתרבות. ברגע תרבות מוקמת, הזהות צריכה להיות מאומתת על ידי טביעת אצבע DNA באמצעות ניתוח חוזר טנדם קצר או שיטה דומה, השוואת התרבות למדגם של הגידול המקורי נשמר למטרה זו. אנו ממליצים אימות תרבויות באופן שיגרתי על ידי DNA טביעת אצבעות, כדי לוודא ששום זיהום על ידי תרבויות אחרות התרחש, למשל כל 3 - 6 חודשים.
הדור של תרבויות DIPG חולה הנגזרת הללו מייצג צעד חשוב בפיתוח המוצלח של טיפולים יעילים. הרחבת תרבויות DIPG נגזר המטופל הזמין ומודלי xenograft תהיה קריטית בזיהוי האסטרטגיות הטיפוליות היעילות ביותר, ובסופו של דבר להתגבר על המחלה הרסנית הזאת.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים בתודה להכיר תמיכה מקרן מק'קנה קלייר, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS K08NS070926 ו R01NS092597), משרד ההגנה (NF140075), קליפורניה מכון לרפואת הרגנרציה (CIRM RB4-06093 ו RN3-06510), הלימונדה של אלכס סטנד Foundation, The Cure מתחיל עכשיו קרן DIPG שיתופית, Lyla נסולי קרן, לפענח סרטן ילדים, קרן גידול ילדות המוח, מתיו לארסון קרן, קרן V, גודפרי קרן משפחת לזכרו של פיונה פנלופה, קרן DIPG Wayland וילאר, דילן Jewett , קונור ג'ונסון, זואי גאנש, דילן פריק, אביגיל ג'נסן, והקרנות הזיכרון ג'ניפר קרנץ, קרן N8, וירג'יניה ו DK לודוויג קרן לחקר הסרטן, המכון לחקר בריאות הילד בסטנפורד אן ט ורוברט מ בס הפקולטה נתרמו מלגות Pediatric מחלות סרטן הדם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
